miR-199a通过NF-κB通路抑制子宫内膜干细胞黏附和侵袭的机制研究

杨爱仲 梁程程 胡天祺 杨红

子宫内膜异位症(endometriosis，EMs)是育龄期女性常见病，发病率10%～15%，在不孕及慢性盆腔痛女性中，发病率更高达40%～50%[1]。当前对EMs的治疗主要采取手术和激素类药物治疗，然而，无论何种治疗，2年复发率为21.5%，5年复发率在40%～50%[2]。因此，进一步研究阐明EMs发生发展的病理机制，寻求确实安全、有效的防治其复发的方法，成为当前EMs研究的首要任务。子宫内膜干细胞(endometrial stem cells，EnSCs)是子宫内膜中具有自我更新、无限增殖及多向分化能力的成体干细胞[3]。自2004年首次被分离鉴定至今，越来越多的研究证实EnSCs在EMs的发生发展和复发中具有关键性的作用[4]。研究证实，EnSCs较子宫内膜细胞具有更强的黏附、侵袭及血管生成能力，随逆流的经血到达腹腔后，突破腹水、腹腔细胞和腹膜细胞外基质3道防线，在“异地”生长，从而形成内异灶[5,6]。与在位EnSCs相比，异位EnSCs显示出进一步增强的侵袭和血管生成能力[7,8]。此外，与子宫内膜细胞不同，EnSCs不表达雌激素受体[9]。因此，探明影响EnSCs增殖和侵袭能力的机制成为近年EMs预防和治疗的研究热点。微小RNA(microRNA，miRNA)是一类长度19～25个核苷酸的非编码RNA分子，可通过转录后沉默或刺激转录物降解来调节基因表达[10]。研究显示，与对照组相比，EMs患者的腹腔液、血浆、子宫内膜及内异病灶中存在多种miRNA水平的下降，且miRNA水平与VEGF-A等血管生成因子负相关[11-13]。miRNA通过抑制子宫内膜基质细胞或子宫内膜干细胞的增殖，促进孕激素抵抗或氧化应激等途径，抑制EMs的进程[14,15]。miR-199a是较早发现的人类miRNA之一。研究发现，与健康者受试者相比，EMs患者在位子宫内膜、卵巢内膜囊肿及血清miR-199a的表达均降低，且EMs患者异位子宫内膜组织的miR-199a表达较在位子宫内膜进一步降低[16,17]，这一变化与EnSCs黏附侵袭能力的改变相一致。Hsu等[17]在动物模型中发现miR-199a-5p可以减少子宫内膜异位病灶的大小，体外实验中miR-199a-5p的上调抑制了EnSCs的增殖、运动和血管生成，进一步证实了miR-199a的降低增加了EnSCs的黏附侵袭能力，在EMs的发生发展、复发转移中发挥了关键的作用。本研究进一步探讨miR-199a对EnSCs黏附和侵袭的作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器 胎牛血清(GIBCO,10270-106)，DMEM/F12培养基(GIBCO BRL)，青霉素、链霉素(Sigma-Aldrich)，0.25%胰酶(上海康朗)，EDTA (Thermo Fisher Scientific)，2×SYBR Green Mix(南京诺唯赞，北京国药)，RIPA强裂解液(碧云天)，6× loading buffer(TransGen Biotech)，Trizol(Invitrogen)，Prime Script TM Master Mix(Takara,RR036A)，EnSCs、Oct-4抗体、Nanog抗体、SOX2抗体(Abcam)，miR-199a抑制剂(上海吉玛)，siRNA(si-p65)(上海吉玛)，原代子宫内膜干细胞(杭州易文赛)；超净工作台(苏州净化)，高速冷冻离心机(德国Eppendorf)，紫外光度仪(日本SHIMADZU)，移液器、实时荧光定量PCR仪(德国Eppendorf)、Western blot装置(美国Bio-Rad)。

1.2 实验方法

1.2.1 原代细胞培养:将细胞悬液转移至DMEM/F12培养基中(含10%胎牛血清和1%双抗)，置于37℃，5% CO2的恒温培养箱中培养。倒置显微镜下观察细胞形态和生长状态，待细胞融合达到80%～90%时，用0.25%胰酶-0.1EDTA消化液消化，1∶2传代，实验时取第3代细胞。

1.2.2 实时荧光定量PCR:Trizol法提取细胞总RNA后进行逆转录反应，反应条件为37℃，15 min，85℃，5 s，4℃，10 min。按免疫荧光定量试剂盒进行定量，反应条件为反应条件：95℃，5 min变性；95℃，5 s；60℃，31 s，40次循环。

1.2.3 Western blot:RIPA裂解液裂解细胞，BCA法进行蛋白质定量，加入上样缓冲液后，98℃水浴锅煮沸5～10 min，室温冷却后-80℃冰箱分装备用。12% SDS聚丙烯酰胺凝胶，60 V恒压60 min，120 V恒压60～90 min分离蛋白，220 mA恒流60～90 min转移至PVDF膜，放入5% BSA中37℃封闭1 h。4℃孵育摇床(80～100 r/min)过夜孵一抗，TBS-T洗膜3次，15 min/次，37℃恒温摇床(80～100 r/min)振荡1 h孵二抗，TBS-T 洗3次，每次10 min，ECL显影，条带用软件Image J分析处理。

1.2.4 siRNA敲除NF-κB p65亚基表达:siRNA sense5’-ACUUUUUUGAAUUUCUGUCAC-3’，anti-sense5’-GACAGAAAUUCAAAAAAGUGG-3’。当培养皿中的原代EnSCs融合达80%时，胰酶消化后将其接种于24孔板中。24 h后将培养基置换Opti-MEM 无血清培养基。按试剂盒说明书，将siRNA配置成浓度20 μmol/L的储备液，分别取5 μl siRNA和5 μl TransLipid HL加入各250 μl Opti-MEM 无血清培养基中，静置5 min，将二者轻柔混合，室温静置20 min后，取混合液加入24孔板中。置培养箱中培养6 h后将培养基更换为完全培养基，继续培养24、48 h，收集细胞。

2 结果

2.1 子宫内膜干细胞鉴定 细胞传代后，经10d培养，镜下见EnSCs呈纤维样细胞形态，中间宽，两端尖，细胞排列无极性。RT-PCR鉴定EnSCs相关标志物Oct4、Sox2、Nanog、Musashi-1、C-Kit阳性。western blot鉴定Oct4、Sox2、Nanog蛋白表达阳性。见图1～3。

100倍镜下200倍镜下

图2 EnSCs相关标志物的RT-PCR鉴定;M DNA marker;1 Oct4;2 Sox2;3 Nanog;4 Musashi-1;5 C-Kit图3 EnSCs相关标志物的western blot鉴定

2.2 miR-199a负性调控NF-κB的表达 用miR-199a抑制剂或阴性对照处理EnSCs，48 h检测蛋白表达， 发现NF-κB通路IKKβ、NF-κBp65的蛋白水平均上调，pIκB-α的水平也上调，差异有统计学意义(P<0.05)。见图4，表1。

表1 2组EnSCs中NF-κB信号通路相关蛋白相对表达量

图4 在EnSCs中，分别转染miR-199a抑制剂(miR-199a inhibitor)或阴性对照(negative control,N.C)后蛋白水平

2.3 NF-κB对侵袭相关分子的调控 分别用NF-kBp65特异性siRNA(si-p65)或siRNA-NC转染细胞，48小时后检测，E-cadherin与TIMP-1的mRNA和蛋白表达均上调，而MMP2与MMP9的mRNA和蛋白表达均下调，差异有统计学意义(P<0.05)。见图5，表2、3。

图5 在EnSCs中，分别转染NF-κBp65特异性siRNA(si-p65)或阴性对照后侵袭相关分子mRNA水平

表2 2组EnSCs中相关侵袭因子蛋白相对表达量

表3 2组EnSCs中相关侵袭因子mRNA相对表达量

3 讨论

miR-199a前体由人类1号染色体(Chr1)和19号染色体(Chr19)上的内含子区域合成，其表达主要受两种机制调节：Chr1的转录因子TWIST1和EGR1、Chr1和Chr19上miR-199a启动子的甲基化状态。随后，miR-199a前体经过进一步加工后以MiR-199a-5p和MiR-199a-3p两种成熟形式发挥作用[18]。miR-199a在不同组织中的表达模式和功能具有多样性。Li等[19]发现miR-199a-5p在小鼠和人类非小细胞肺癌中下调，miR-199a-5p通过靶向MAP3K11基因，抑制非小细胞肺癌细胞增殖，使细胞周期停滞在G1期，具有抗肿瘤作用。Qu等[20]则发现miR-199a-5p在宫颈癌患者组织和细胞中上调，miR-199a-5p，miR-199a-5p靶向调节PIAS3表达，促进宫颈癌的细胞增殖和转移。导致miR-199a这种功能差异的原因可能是在不同组织和细胞中下游靶标的不同。在侵袭方面，研究发现miR-199a通过靶向Integrin 3、HIF-1α、NF-κB等诸多途径抑制细胞黏附和侵袭[21,22]。Dai等[16]发现miR-199a通过抑制IKKβ/NF-κB通路和减少IL-8表达抑制子宫内膜基质细胞的侵袭。

静息状态下，NF-κB与IκB家族结合，以无活性的形式存在于细胞质中。刺激物通过介导IκB激酶(IKK)对IκB的磷酸化，使IκB泛素化降解。NF-κB随后转移到细胞核上，通过与启动子中的靶序列结合激活靶基因的转录，从而参与炎症、免疫、细胞增殖和细胞凋亡等多种生理、病理过程[23]。Zhang等[24]通过体外实验证实，子宫内膜基质细胞NF-κB通路的激活会促进细胞的增殖、迁移和侵袭。EMs患者内异组织、外周血等均存在NF-κB通路的过度活化[25,26]，并伴有E-cadherin、MMPs表达增多， TIMPs表达下降[25,27,28]。E-cadherin、MMP-2、MMP-9均为迁移和侵袭相关因子，在肿瘤细胞、滋养细胞等细胞中均被证实与细胞的迁徙、侵袭密切相关。其中E-cadherin属于I型经典粘钙蛋白，是有效的肿瘤抑制因子，E-cadherin的下降与肿瘤的发生、扩散相关[29]。在EMs的研究中，EMs疾病进程与E-cadherin呈负相关[30]，在位内膜较异位内膜组织E-cadherin水平高[31]。MMPs是锌依赖性内切蛋白酶家族，在组织重塑和细胞外基质多种蛋白的降解中具有重要作用。MMPs受TIMPs抑制性调节，MMP/TIMP比值通常决定蛋白降解和组织重塑的程度[32]。研究发现，因EMs行IVF的女性血清和卵泡液中的MMP-2和MMP-9水平升高，TIMP-1水平下降，并与卵泡质量下降和胚胎发育异常相关[33]，MMP-2、MMP-9可以作为EMs组织或细胞侵袭能力以及治疗有效性的检测指标[33,34]。

本实验研究中，用miR-199a抑制剂处理EnSCs后，发现NF-κB通路IKKβ、NF-κBp65的蛋白水平均上调，pIκB-α的水平也上调，表面miR-199a负性调节NF-κB通路；而后用siRNA敲除NF-κBp65，发现E-cadherin与TIMP-1的mRNA和蛋白表达上调，而MMP-2与MMP-9的mRNA和蛋白表达下调，表明在EnSCs中，NF-κB的过度活化同样和细胞的迁移、侵袭相关。本实验证实在EnSCs中，miR-199a通过负性调控NF-κB通路，抑制EnSCs的迁移和侵袭，从而抑制EMs的发生和进展。

Maged等[35]通过对45名EMs患者和35名因其他病行腹腔镜的患者进行前瞻性队列研究，发现EMs患者血清和腹腔液miR-199a水平升高，对EMs诊断的敏感性和特异性均为100%。Wang等[36]同样发现EMs患者血清miR-199a上调，并与EMs病变程度、病变分布和骨盆粘连密切相关，miR-199a结合miR-122、miR-145 *和miR-542-3p诊断EMs的敏感性为93.22%，特异性为96.00%。在国内，袁琳等[37]同样证实EMs患者血清及腹腔液中miR-199a-5p表达增加。这些关于研究证实EMs患者血清和腹腔液中上调的miR-199a可以作为EMs诊断的新靶标。然而多数研究表明EMs病灶组织和细胞中mir-199下调导致了EMs的发生。要对这一相反的结果进行验证，首先有待于更多实验证实血清、腹腔液和EMs组织、细胞中的miR-199a变化趋势；其次考虑可能原因为miR-199a在EMs患者机体中的分布存在异常，或血清、腹腔液中的miR-199a与EMs病灶组织和细胞中的mir-199存在某种负反馈机制，这些猜想有待于进一步的实验明确mir-199的来源、分泌和分布等。

本实验研究证实了miR-199a对EnSCs黏附、侵袭能力的抑制作用和机制，为通过miR-199a及其下游靶标NF-κB通路降低EnSCs的侵袭，从而治疗EMs患者，尤其是手术或激素治疗效果不佳、二次复发的患者带来了新的希望。