罗哌卡因诱导大鼠脊髓背角细胞凋亡中Fas/FasL的表达*

张釜于，曾炼，罗昭，桑明，孙晓东，罗辉宇

(湖北医药学院附属襄阳市第一人民医院1.麻醉科；2.中心实验室；3.帕金森临床研究中心；4.武当特色中药研究湖北省重点实验室，襄阳 441000)

罗哌卡因是临床上应用广泛的局部麻醉(局麻)药[1-2]，但应用于椎管内麻醉时可能引起短暂神经综合征和马尾综合征等神经损伤症状[3-4]，甚至产生永久的运动及感觉异常，这与其对脊髓神经元的毒性密切相关[5]。罗哌卡因引起神经毒性的机制目前尚不清楚，其中神经元凋亡增多是重要基础[6]。研究发现，罗哌卡因可以导致线粒体膜去极化，提高细胞内pH值，引起细胞色素C的释放，通过凋亡诱发神经毒性[7]。除线粒体途径外，还有报道罗哌卡因可诱导细胞中多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1[poly (CADP-ribose)polymerase-1，PARP-1]活化和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)耗竭，启动caspase非依赖的凋亡，引起神经毒性[8]。

Fas/FasL是死亡受体途径中介导外源性细胞凋亡的重要分子。其中Fas又称作APO-1/CD95，属于肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor ，TNF)受体家族重要成员，广泛表达于多种组织和细胞中，多见于活化的淋巴细胞，其在细胞凋亡和免疫调节中发挥重要作用。Fas与Fas配体(Fas ligand，FasL)结合可激活Fas相关死亡结构域(Fas associated death domain，FADD)和procaspase-8，活化caspase-3[9]，最终导致细胞凋亡。Fas/FasL被证明在罗哌卡因处理的PC12细胞中表达上调[10]，并可在脊髓外伤中诱导神经元凋亡[9，11]，但其在局麻药引起的脊髓神经元毒性中作用尚不明确。本实验通过鞘内注射不同浓度罗哌卡因，探究Fas/FasL是否与罗哌卡因诱导的大鼠脊髓背角细胞凋亡有关。

1 材料与方法

1.1实验动物 选取清洁级健康雄性SD大鼠25只，体质量180～200 g，6～8周龄，由湖北医药学院实验动物中心提供，实验动物生产许可证号： SCXK(鄂)2016-008。置于适宜环境，温度：(22±2)℃，相对湿度：50%～60%，每天光照12 h，自由进食水，适应性饲养1周。实验由襄阳市第一人民医院动物伦理委员会批准，伦理审查编号：2018DW003。

1.2主要试剂与仪器 盐酸罗哌卡因(江苏恒瑞医药公司，纯度>98%，批号：200115CA)；PE-10导管(Smith medical公司，批号：800/100/100)；Tunel染色试剂盒(Roche公司，批号：11684817910)；DAPI染液(批号：G1012)和兔抗大鼠 Fas、FasL多克隆抗体(批号：GB11089、GB11090-1)均购自Servicebio公司；苏木精-伊红(HE)染色试剂盒(碧云天生物技术有限公司，批号：C0105)；EVF3型电子测痛仪(Von Frey公司)；IX-71型倒置荧光显微镜(Olympus公司)；RM2016型病理切片机(上海徕卡公司)。

1.3动物分组、模型制作及给药 按照随机数字表法分为空白对照组、模型对照组及罗哌卡因小、中、大剂量组(0.5%，1%，2%)，每组5只。除空白对照组外，其余各组大鼠均进行鞘内置管。大鼠鞘内置管模型的制作：称定质量后，除空白对照组外，其余4组大鼠腹腔注射10%水合氯醛0.35 g·kg-1麻醉。参照文献[12]方法，将无菌的PE10导管沿硬脊膜破口置入蛛网膜下2 cm，导管内可见脑脊液回流证明置管成功。充分冲洗导管后，逐层缝合，并将导管沿皮下固定至颈后。观察大鼠术后恢复情况，排除术后出现下肢活动异常的大鼠。模型制作完成，在造模后第3天，使用微量注射器鞘内注射1%利多卡因20 μL，并予以0.9%氯化钠溶液10 μL冲洗导管，若大鼠在30 s内出现双侧下肢麻痹、躲避反射和夹尾反射消失，同时双上肢反射存在，并能2 h内恢复，则证明利多卡因筛选实验阳性，模型制作成功。参照文献[13]，对造模成功大鼠鞘内分别注射0.9%氯化钠溶液和罗哌卡因(浓度分别为0.5%，1%和2%)，注射剂量均为0.12 mL·kg-1，注射时间12 h，每间隔1.5 h注射一次，共8次。空白对照组无处理。

1.4行为学观察 采用电子测痛仪检测大鼠机械性缩足反射阈值(mechanical withdrawal threshold，MWT)。操作如下：将待测大鼠置于底部打孔的有机玻璃箱中，底部为铁丝网，使其适应环境15 min，使用电子测痛仪探针刺激大鼠后足掌部皮肤，逐渐加压；当大鼠出现缩足反应时，仪器自动记录引起缩足所需的刺激大小，即为大鼠MWT。每只大鼠进行3次检测，每次检测间隔15 min，分别在造模前1 d、给药前(造模后3 d)和鞘内给药24 h后进行测量。

1.5组织取材与HE染色 给药完毕后24 h，腹腔注射大鼠10%水合氯醛0.35 g·kg-1麻醉，处死后剪开脊柱，取脊髓腰膨大组织，加入4%多聚甲醛固定12 h，蜡块包埋，组织切片，依据试剂盒说明书完成HE染色，光镜下观察脊髓组织结构的完整性，比较各组形态学改变。

1.6TUNEL染色 组织切片脱蜡至水，进行抗原修复和破膜。按试剂盒说明书取TUNEL试剂覆盖组织，37 ℃水浴锅孵育2 h，后用磷酸盐缓冲液(PBS，pH值7.4)洗涤3次，每次5 min。去除PBS后，加DAPI染液避光，室温孵育10 min复染细胞核，最后用抗荧光淬灭封片剂封片，使用倒置荧光显微镜(200倍)观察切片并采集图像，每组选取脊髓背角3个随机视野，统计TUNEL染色阳性细胞比例。

1.7免疫组织化学 各组包埋的蜡块切片脱蜡至水。切片抗原修复后予以PBS洗涤3次，用3%过氧化氢溶液阻断内源性过氧化物酶。切片在3% BSA室温封闭30 min，分别加入Fas抗体(1：200)、FasL抗体(1：500)孵育；洗涤后加入一抗相应种属辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗(1：200)，室温孵育50 min。玻片置于PBS洗涤3次，加入DAB显色液，自来水冲洗切片终止显色。苏木精复染细胞核，裱片、荧光封片剂封片。每组选取4个随机视野，显微镜下(400倍)观察并采集图像，使用ImageJ软件计算视野下平均光密度。

2 结果

2.1MWT检测值 与空白对照组比较，各模型组大鼠造模前后MWT均差异无统计学意义(P>0.05)。模型对照组和罗哌卡因小剂量组给药24 h后，MWT与给药前比较差异无统计学意义(P>0.05)，罗哌卡因中、大剂量组MWT较给药前升高明显，差异有统计学意义(P<0.05)，提示高浓度罗哌卡因易引起感觉异常的神经损伤症状。见表1。

表1 5组大鼠机械性缩足反射阈值

2.2对大鼠脊髓神经元凋亡的影响 低倍镜(40×)下TUNEL荧光染色结果，显示各组中大鼠脊髓组织轮廓清晰。高倍镜(×200)下，空白对照组和模型对照组中仅存在少量凋亡细胞，差异无统计学意义(P>0.05)；罗哌卡因组均可在脊髓背角见到明显增多的凋亡细胞，见图1。与模型对照组比较，罗哌卡因组高倍视野下脊髓背角凋亡细胞比例增大，差异有统计学意义(P<0.05)；与罗哌卡因小剂量组比较，罗哌卡因大剂量组凋亡细胞比例增大，差异有统计学意义(P<0.05)，见图2。

2.3脊髓组织形态改变 HE染色可见各组脊髓组织结构较为完整。空白对照组和模型对照组脊髓背角中神经元形态良好，核膜完整，细胞核深染致密，灰质白质清晰，神经细胞排列均匀，未见明显的炎性细胞浸润。罗哌卡因小剂量组可见脊髓背角间质轻度水肿，少量空泡形成；罗哌卡因中、大剂量组中脊髓背角间质水肿明显，大量空泡形成并可见部分神经元核膜溶解，细胞核固缩、溶解、消失。见图3。

A.空白对照组；B.模型对照组；C.罗哌卡因小剂量组；D.罗哌卡因中剂量组；E.罗哌卡因大剂量组。

A.空白对照组；B.模型对照组；C.罗哌卡因小剂量组；D.罗哌卡因中剂量组；E.罗哌卡因大剂量组。①与模型对照组比较，t=3.51～11.97，P<0.05；②与罗哌卡因小剂量组比较，t=4.36，P<0.05。

2.4脊髓组织中Fas、FasL表达的影响 Fas、FasL免疫组化阳性表达主要表现为神经元胞质着色，呈棕褐色的颗粒沉着。空白对照组与模型对照组中大鼠脊髓灰质背角细胞中仅有极低Fas和FasL表达，表达水平差异无统计学意义。与模型对照组比较，罗哌卡因组脊髓组织中Fas表达水平均升高(P<0.05)；与罗哌卡因小剂量组和罗哌卡因中剂量组比较，罗哌卡因大剂量组Fas表达升高，差异有统计学意义(P<0.05)。仅罗哌卡因大剂量组FasL表达明显高于模型对照组(P<0.05)，见图4，图5。

3 讨论

神经损伤是局麻药应用于临床麻醉的并发症之一[14]，传统治疗方法恢复过程缓慢，疗效不理想，且无明确的预防措施。针对神经损伤，局麻药引起神经毒性的机制一直是重要的研究方向。本实验选取成年雄性SD大鼠制作鞘内置管模型，通过鞘内给予不同浓度罗哌卡因模拟临床中长时间椎管内麻醉，探究局麻药引起神经损伤的可能机制。结果显示，与鞘内给药前比较，1% 和2% 浓度罗哌卡因处理24 h后，大鼠后足MWT明显上升；与模型对照组比较，鞘内注射罗哌卡因后，脊髓背角间质明显水肿、空泡增多，背角细胞的凋亡水平随罗哌卡因浓度增加而增加，提示高浓度罗哌卡因更易诱导脊髓神经元的凋亡并引起感觉异常等神经损伤症状；同时罗哌卡因处理组中Fas、FasL表达水平较模型对照组明显增加，呈剂量依赖。由此推断：Fas/FasL可能参与罗哌卡因诱导大鼠脊髓背角细胞凋亡的过程。

A.空白对照组；B.模型对照组；C.罗哌卡因小剂量组；D.罗哌卡因中剂量组；E.罗哌卡因大剂量组。

A.空白对照组；B.模型对照组；C.罗哌卡因小剂量组；D.罗哌卡因中剂量组；E.罗哌卡因大剂量组。

A.空白对照组；B.模型对照组；C.罗哌卡因小剂量组；D.罗哌卡因中剂量组；E.罗哌卡因大剂量组。①与模型对照组比较，t=5.26～10.10，P<0.05；②与罗哌卡因小剂量组比较，t=3.17，P<0.05；③与罗哌卡因中剂量组比较，t=3.67，P<0.05。

针对调控Fas/FasL的表达，近期研究发现，通过siRNA干扰p38 MAPK可明显抑制PC12细胞和U87细胞中Fas的表达水平[15]，提示p38 MAPK可能是调控Fas表达的上游分子，而其是否参与调节罗哌卡因诱导的脊髓组织中Fas表达上调值得进一步探究。本课题组下一步将通过siRNA和p38 MAPK抑制剂干扰Fas/FasL通路进一步验证Fas/Fasl在罗哌卡因诱导神经毒性中的具体作用。

综上所述，本研究发现在鞘内注射罗哌卡因诱导大鼠神经损伤和脊髓背角细胞凋亡的过程中Fas/FasL的表达增加，提示Fas/FasL可能参与了罗哌卡因诱导的神经毒性，这为临床预防和治疗罗哌卡因引起的脊髓神经损伤提供理论基础和实验依据。