儿童肾穿刺活检免疫荧光技术实践与分析

李晓未，陈 志，王兴东，朱雪明

（1.苏州大学附属儿童医院病理科，江苏 苏州 215025；2.苏州大学附属第一医院病理科，江苏 苏州 215006）

肾脏疾病主要由肾小球和肾小管结构及功能上的病变引起，发病率逐年增高。随着医疗水平的进步，肾穿刺活检越来越广泛地应用于临床[1]。肾穿刺活检损伤小，获取的组织新鲜，不仅适用于常规病理检查，更适合免疫荧光病理及电子显微镜检查[2]。HE组织形态、特殊染色、免疫荧光加电镜观察能够更准确、更迅速地明确诊断和分类，为临床治疗、判断预后提供重要依据。现根据我科多年的肾穿刺免疫荧光实践操作经验，对该方法提出几点改进和体会，介绍如下。

1 材料与方法

1.1 临床标本 所有标本均来自2019年我院肾内科行肾穿刺活检的病理标本，新鲜的肾穿刺标本用生理盐水浸湿的纱布包裹，密闭容器盛装，贴好标签，冰盒中送检至病理科。

1.2 材料 恒冷切片机（Leica）、荧光显微镜（LeicaNikon）、湿盒、光学显微镜（OLYMPUS）、37 ℃水浴恒温箱。

1.3 试剂 荧光抗体（IgG、IgM、IgA、C1q、C3、Fibrinogen）、及Wieslab®Alport's Syndrome Kit（检测Ⅳ型胶原α3链、α5链）、0.01 mol/L pH7.14 PBS、缓冲甘油等。

1.4 冰冻切片 ①先将OCT包埋剂均匀涂抹于冻头上，放置冰冻切片机内使其冷却凝固。②修去表面的包埋剂使其表面平整，用组织镊将肾穿刺组织水平放置在冻头上，务必使其在同一水平面。③在组织周围再加少许包埋剂，放入冰冻切片机，待其凝固。④固定好冻头，缓慢细修，使组织充分暴露出来，正式切片3 张，厚度5 μm，每张切片放3 块组织，注意中间留有一定间距。

1.5 免疫荧光染色经典方法

1.5.1 IgG、IgM、IgA、C1q、C3、Fibrinogen荧光标记：①每个指标切1 张冰冻切片，室温干燥后，丙酮固定10 min，PBS洗3 次。②滴加FITC标记的抗体，37 ℃孵育45 min，PBS洗3 次。③甘油封片，荧光显微镜阅片，拍照保存。

1.5.2 Ⅳ型胶原α3链、α5链荧光标记：①同样冰冻切片后常温下干燥、丙酮固定10 min，先对α5链标记样本滴加试剂盒中提供的甘氨酸/尿素溶液置4 ℃冰箱中孵育5 min，PBS洗3 次。②分别在α3链、α5链标记样本上滴加相应的单抗试剂，37 ℃湿盒中孵育1 h后再用PBS洗3 遍。③分别滴加FITC标记的荧光二抗（注：α3链为抗小鼠荧光抗体、α5链为抗大鼠荧光抗体），37 ℃湿盒中孵育1 h后再用PBS洗3 遍。④甘油封片，荧光显微镜阅片，拍照保存。

1.6 免疫荧光染色改良方法

1.6.1 IgG、IgM、IgA、C1q、C3、Fibrinogen荧光标记：①每张切片放3 块组织，室温干燥后用记号笔在玻片背面做标记（图1）。②每张玻片上不同的组织样本上分别滴加不同的FITC标记的抗体10 μL。37 ℃孵育45 min。③PBS滴洗3 次，用吸水纸除去组织周围多余液体后，直接荧光显微镜阅片，拍照保存。

图1 组织排列及玻片标记

1.6.2 Ⅳ型胶原α3链、α5链荧光标记：①冰冻切片时1 张切片上放置2 块组织，常温下干燥后同样在背面作好标记（1 块组织作α3链标记、另1块组织作α5标记），先对α5链标记样本滴加10 μL甘氨酸/尿素溶液置4 ℃冰箱中孵育5 min，PBS滴洗3 次。②用吸水纸分别擦干样本周边液体，在α3链、α5链标记样本上滴加相应的单抗试剂10 μL，37 ℃湿盒中孵育1 h后再用PBS滴洗3 遍。③用吸水纸分别擦干样本周边液体，分别滴加FITC标记的荧光二抗10 μL。37 ℃湿盒中孵育1 h。④PBS滴洗3 次，用吸水纸除去组织周围多余液体后，直接荧光显微镜阅片，拍照保存。

2 结果

阳性的信号在荧光显微镜下可见黄绿色的荧光，代表有相应的免疫复合物沉积（图2）。根据荧光强弱的程度，结果可分为±（可疑阳性）、+（弱阳性）、++（中等阳性）、+++（强阳性）。IgA阳性信号定位于肾小球系膜区，IgA肾病往往呈现强阳性（图2A）。IgM信号见于系膜区，IgM沉积可见于系膜增生性肾炎、局灶性节段性肾小球硬化等疾病（图2B）。C1q沉积在肾小球基底膜和肾小球系膜，可见于狼疮性肾炎等（图2C）。C3阳性荧光可见于毛细血管内增生性肾小球肾炎、膜性肾炎、膜增生性肾炎、IgA肾病等多种疾病（图2D）。

图2 改良免疫荧光标记法检测IgA、IgM、C1q、C3免疫复合物

采用免疫荧光法还可检测IgG、Fibrinogen等免疫复合物，采用此改良法检测肾小球多种免疫复合物方便、快捷、阳性信号定位准确、背景干净、效果满意。

此外，肾小球Ⅳ型胶原α3链、α5链也可用该改良法检测，由于α3链、α5链的检测采用的是间接免疫荧光法，用此改良法更节省时间和试剂[3]。用改良免疫荧光方法检测Alport综合征患者的肾穿刺标本，可见特异性的α3、α5信号缺失（图3），正常肾小球Ⅳ型胶原α3链、α5链信号均呈现明亮的黄绿色荧光，呈线性（图3A）；而Alport综合征患者的肾小球Ⅳ型胶原α3链、α5链均为阴性或荧光信号部分缺失（图3B）。α3链、α5链的免疫荧光结果可以作为诊断Alport综合征的重要依据和指标。

图3 正常肾小球及Alport综合征肾小球Ⅳ型胶原α3链、α5链免疫荧光

3 讨论

要取得科学、准确、可靠的免疫荧光染色报告，前提需要提供合格的肾穿刺标本[4]。首先，穿刺的肾组织需要有一定数量的肾小球，因为肾小球是观察病变和免疫复合物沉积的重要组织结构。在收到肾穿刺标本后应当在显微镜下观察组织是否带有足够肾小球，确认肾小球数量、锋利刀片进行分割、避免挤压组织[5]。我院为儿童专科医院，儿童肾穿刺使用更细的穿刺针，因而穿刺标本更加细小，操作应更加仔细。我们认为做免疫荧光检查的标本肾小球数量应≥5 个[6]。用于荧光标记的活检组织应当全程使用生理盐水浸湿的纱布包裹（但应挤掉多余水分），放入密闭小瓶中，做标记，冰盒中送检、转运，尽快送至病理科切片。切勿接触任何福尔马林或酒精、戊二醛等固定试剂。

在我们采用的改良方法时，省去了丙酮固定的步骤，实践检验发现，即使没有这一步骤也不会影响结果的准确性，不会影响荧光的定位和强度。如果PBS清洗得不彻底，导致丙酮残留的话，反而会影响免疫荧光的结果。此外丙酮有刺激性气味，易挥发，省去丙酮也可减少对人体的伤害。

此改良方法采用1 张玻片贴3 张组织，用记号笔画圈后可分别滴加不同的抗体。滴加抗体时，以抗体能覆盖住整个组织切面为宜，通常10 μL即可，此法也可节省抗体的用量。同时在湿盒内加入适量的蒸馏水，孵育时间不要超过40 min，这样既能保证作用时间、又不会使样本中的液体互相融合或干涸，保证了荧光染色标记的效果[7]。清洗时使用滴管吸取PBS，用滴洗的方法清洗，方便快捷。肾穿刺免疫荧光通常需要制作6～8 个抗体。该法可节省耗材、试剂，节省量可达1 倍以上，且操作时间也得到了节省，避免了因操作时间延长导致的组织干涸而影响结果。且染色结束PBS清洗后无需封片，擦去周围水分便可直接放置于荧光显微镜下观察，清晰度不受影响。

Alport综合征（遗传性肾炎）是一种主要表现为血尿、肾功能进行性减退、感音神经性耳聋和眼部异常的遗传性肾小球基底膜疾病，是由于编码肾小球基底膜的主要胶原成分Ⅳ型胶原基因突变而产生的疾病[8]。应用特异性的抗Ⅳ型胶原不同α链的抗体（α3、α5）在肾脏组织进行免疫荧光检测，可以诊断X连锁显性遗传型男性、女性以及常染色体隐性遗传型Alport综合征[9]。正常肾小球基膜α3链、α5链阳性，而Alport综合征患者α3链、α5链为特征性缺失，免疫荧光结果呈阴性。目前已常规应用于我院病理科。

除了以上我们提到的改良方法外，免疫荧光切片的制作还受其他多种因素的影响，如抗体浓度、孵育时间，冰晶的形成等[10]。需要操作者不断实践、不断总结学习、不断进步才能做出优秀的切片，发出准确、可靠的报告，为临床诊断、治疗提供帮助。

肾穿刺活检标本除了免疫荧光染色外，还要综合常规病理HE切片、特殊染色切片（PAS、Masson三色、PASM银染）和电镜观察，结合临床症状和特征，综合判断病变部位和类型，才能给出准确的病理结果和分类[11-14]。该文仅对免疫荧光染色的改良方法作出探讨，相信该方法也能逐渐普及并应用于各个病理科室。