丹参酮ⅡA抑制NF-κB磷酸化发挥对脑缺血再灌注大鼠抗炎作用机制研究

李 洁，车玉琴

（中国医科大学附属第四医院神经内科，辽宁 沈阳 110032）

丹参酮ⅡA是从唇形科植物丹参（salvia miltiorrhza）中分离出来的二萜醌类化合物。以往研究显示，丹参酮ⅡA能够抗动脉粥样硬化，改善血脂水平，改善冠心病心绞痛临床疗效并提高甲状腺激素水平[1-3]。近年来，丹参酮ⅡA用于缺血性脑病的研究报道层出不穷[4]，并已发现丹参酮ⅡA对缺血再灌注损伤后脑组织的保护作用。本科室采用丹参酮ⅡA用于缺血性脑损伤的治疗多年，临床观察发现，丹参酮ⅡA抑制缺血早期脑组织炎症反应具有较好临床疗效，为阐明丹参酮ⅡA对缺血性脑病的作用机制，开展了相关研究。

本研究采用线栓法复制大鼠脑缺血再灌注损伤（CIRI）模型，然后给予丹参酮ⅡA进行干预，通过检测大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α含量，以及大鼠脑组织中NF-κB及p-NF-κB的表达水平，阐述丹参酮ⅡA对CIRI大鼠的抗炎作用及部分干预机制，为丹参酮ⅡA用于缺血性脑病的临床治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物：SPF级成年雄性SD大鼠40 只，体重(300±20)g，购于辽宁长生生物科技有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（辽）2010-0001。实验动物购入后，常规颗粒饲料喂养，自由食水，12 h昼夜节律。

1.1.2 实验药品：丹参酮ⅡA，货号：P0019，上海纯优生物科技有限公司；阿司匹林，国药准字H44021139，广东九明制药有限公司。

1.1.3 实验试剂：大鼠IL-1β、IL-6及TNF-α检测试剂盒，购自武汉优尔生商贸有限公司； NF-κB、p-NF-κB抗体，购自北京博奥森生物技术有限公司；HRP标记二抗，购于北京中杉金桥生物科技有限公司；ECL发光试剂盒，购于杭州碧云天生物技术研究所。

1.1.4 仪器设备：酶标仪，MK3型，Thermo公司生产；电泳仪、电泳槽，ESP300型，上海天能公司生产；凝胶成像分析系统，SF4200型，上海天能公司生产。

1.2 实验方法

1.2.1 分组方法：大鼠购入后，适应性饲养1 周。然后采用随机数字表法，将大鼠分为四组：假手术组、模型对照组、丹参酮ⅡA组、阿司匹林对照组，每组10 只。

1.2.2 造模方法：参考马贤德等[5]的研究方法，采用改良的线栓法复制脑缺血再灌注大鼠模型，方法详见参考文献。假手术组大鼠术式同上，但不做钓鱼线栓塞。

1.2.3 模型评价：大鼠术后采用Longa等[6]的研究方法进行评分，来评价模型复制是否成功。各组大鼠术后2 h，待大鼠完全清醒后，观察大鼠行为学体征。0 分：无神经损伤症状；1 分：不能完全伸展对侧前爪；2 分：向对侧转圈；3 分：向对侧倾倒；4 分：不能自发行走，意识丧失。评为1～3 分的大鼠纳入实验，0 分和4 分均不符合研究需求，应予以剔除。

1.2.4 干预方法：假手术组：术后正常饲养，不做处理。模型对照组：术后正常饲养，每日上午，腹腔注射生理盐水1 mL/100 g体重。每日1 次，连续7 d。丹参酮ⅡA组：术后正常饲养，每日上午，腹腔注射浓度为1 mg/mL的丹参酮ⅡA注射液，1 mL/100 g体重。每日1 次，连续7 d。阿司匹林对照组：术后正常饲养，每日上午，经口灌服阿司匹林悬液（1.8 mg/mL），1 mL/100 g体重。每日1 次，连续7 d。

1.2.5 样本采集：末次干预后，各组大鼠经腹腔注射水合氯醛溶液麻醉后，剖开腹壁，暴露腹后壁的腹主动脉，经腹主动脉穿刺采集动脉全血5 mL，室温静置1 h，2 500 r/min离心10 min，分离上清液，冻存于－80 ℃冰箱中备用。大鼠采血后，置于冰面上，断头取脑，将脑组织放在冰面上，用手术刀探查梗死灶，去除梗死灶脑组织，剥离梗死灶周围1.5 mm范围内环形脑组织，收集于1.8 mL冻存管内，冻存于－80 ℃冰箱中备用。

1.2.6 指标检测：

1.2.6.1 一般状态观察：末次给药干预后2 h，观察对比各组大鼠一般状态。

1.2.6.2 血清IL-1β、IL-6及TNF-α含量检测：采用酶联免疫吸附（ELISA）法检测各组大鼠血清中IL-1β、IL-6及TNF-α含量。检测方法按照试剂盒中说明书上实验步骤进行。

1.2.6.3 缺血半暗带脑组织中NF-κB、p-NF-κB表达水平：采用免疫印迹法检测各组大鼠缺血半暗带脑组织中NF-κB、p-NF-κB的表达。裂解法提取脑组织中总蛋白，电泳后转印，一抗二抗杂交后，在PVDF膜上滴加ECL发光液，并置于凝胶成像分析系统中采集图像，采用系统自带软件，测定目的蛋白条带和内参蛋白条带灰度值，并以目的蛋白灰度值/内参蛋白灰度值的比值作为该目的蛋白的相对表达水平，进行统计分析。

1.3 统计学方法 采用SPSS 16.0软件包对各组实验数据进行统计分析，多组间比较采用单因素方差分析的LSD比较方法，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般状态 造模后，剔除评分不符合要求的大鼠及个别死亡大鼠，最终假手术组剩余10 只；模型对照组剩余7 只；丹参酮ⅡA组和阿司匹林对照组各剩余8 只。假手术组大鼠一般状态良好，活动度正常，食水正常。模型对照组大鼠精神萎靡，少动蜷缩并聚堆，食水量明显减少。丹参酮ⅡA组和阿司匹林对照组大鼠状态相似，活动度较模型对照组大，但明显不及假手术组。

2.2 血清IL-1β、IL-6及TNF-α含量检测 各组大鼠血清IL-1β、IL-6及TNF-α含量检测结果显示：与假手术组比较，其余各组大鼠血清中IL-1β、IL-6及TNF-α含量显著升高，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型对照组比较，丹参酮ⅡA组和阿司匹林对照组大鼠血清中IL-1β、IL-6及TNF-α含量显著降低，差异有统计学意义（P＜0.01）。（表1）。

表1 大鼠血清IL-1β、IL-6及TNF-α含量（±s）

表1 大鼠血清IL-1β、IL-6及TNF-α含量（±s）

注：与假手术组比较，*P＜0.01；与模型对照组比较，#P＜0.01。

组别 n IL-1β（pg/mL） IL-6（pg/mL） TNF-α（pg/mL）假手术组 10 33.50±3.59 16.85±1.73 34.21±2.98模型对照组 7 67.52±8.32* 34.04±4.71* 66.92±11.42*丹参酮ⅡA组 8 49.28±5.32*# 26.96±3.16*# 50.12±4.42*#阿司匹林对照组 8 52.09±5.99*# 26.34±2.60*# 53.37±6.75*#

2.3 缺血半暗带脑组织中NF-κB、p-NF-κB表达水平 各组大鼠缺血半暗带脑组织中NF-κB、p-NF-κB的表达水平检测结果显示：与假手术组比较，其余各组大鼠缺血半暗带脑组织中NF-κB、p-NF-κB的表达水平显著升高，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型对照组比较，丹参酮ⅡA组和阿司匹林对照组大鼠缺血半暗带脑组织中NF-κB、p-NF-κB表达水平显著降低，差异有统计学意义（P＜0.01）。（表2，图1）

表2 大鼠脑组织中NF-κB、p-NF-κB的表达（±s）

表2 大鼠脑组织中NF-κB、p-NF-κB的表达（±s）

注：与假手术组比较，*P＜0.01；与模型对照组比较，#P＜0.01。

组别 n NF-κB p-NF-κB假手术组 10 .209±0.029 0.184±0.020模型对照组 7 0.635±0.043* 0.494±0.055*丹参酮ⅡA组 8 0.468±0.049*# 0.342±0.033*#阿司匹林对照组 8 0.483±0.054*# 0.370±0.036*#

图1 大鼠脑组织中NF-κB、p-NF-κB的表达

3 讨论

丹参酮ⅡA对缺血性脑损伤的干预作用已见报道[7-8]。就目前研究进展看，丹参酮ⅡA的抗炎作用较为明确[9]。也有报道丹参酮ⅡA的其他脑保护作用，其对神经生长因子的调节作用[10]等。丹参酮ⅡA的抗炎机制通过调控小胶质细胞的活化而实现[11]，与调节NF-κB的表达水平关系密切[12]。也有关于丹参酮ⅡA的抗凋亡作用相关报道[13]。

我们的研究结果显示，丹参酮ⅡA能够显著降低CIRI大鼠血清中炎性因子IL-1β、IL-6及TNF-α的含量，证明丹参酮ⅡA具有较明确的抗炎作用，这与以往研究结果一致。但以往研究并未对其调控NF-κB信号通路的深入机制展开探索。为此，我们进一步检测了NF-κB信号通路中关键分子的表达。结果显示，模型对照组大鼠脑组织中NF-κB、p-NF-κB表达水平异常升高，提示，发生缺血再灌注损伤后，大鼠脑组织中NF-κB信号通路处于异常活化状态，而丹参酮ⅡA干预后，能够使NF-κB、p-NF-κB表达水平均显著受到抑制，这一结果提示我们，丹参酮ⅡA不仅通过下调NF-κB的表达水平而发挥抗炎作用，更为重要的是丹参酮ⅡA有效地抑制了NF-κB的磷酸化发生，从而抑制了NF-κB信号通路活化，从而更好地发挥了抗炎作用。

综上所述，我们认为丹参酮ⅡA对CIRI大鼠缺血半暗带脑组织中的炎症反应具有明确的抑制作用，而这一作用的发挥与其能够抑制NF-κB信号通路过度活化关系极为密切。