NAD的耗尽与补充对髓核细胞的退行性变的影响

许琮欣，堵嘉诚，杜 彤，谢依彤，王鹏博，戴顺捷，毛海青，杨惠林

（1.苏州大学附属第一医院骨科，江苏 苏州 215006；2.苏州大学医学部，江苏 苏州 215123）

退行性椎间盘疾病（degenerative disc disease,DDD）是导致腰背痛的主要原因之一，其成因复杂，发病原理至今尚不明确[1-2]。髓核细胞（nucleus pulposus cells, NPCs）是髓核组织的细胞成分，其状态直接影响髓核组织的形态与功能[3]。髓核组织的结构与功能退行性变被认为是椎间盘退行性变（intervertebral disc degeneration, IVDD）的主要原因[1]。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide, NAD）是细胞的生命活动中重要的生物小分子[4]。FK866是烟酰胺磷酸核糖转移酶（nicotinamide phosphoribosyltransferase, NAMPT）的特异性抑制剂，阻止细胞内NAMPT利用烟酰胺合成烟酰胺单核苷酸（nicotinamide mononucleotide,NMN）进而阻止NAD的合成代谢[4]。NAD水平的异常可造成多种细胞的生理功能障碍，并导致相关疾病的发生发展[5-7]。然而，NAD的含量是否及如何影响NPCs的退行性变，目前尚不清楚。本研究通过FK866与NMN调节NPCs的细胞内NAD水平，初步阐释NAD合成代谢障碍所致的NAD水平异常波动对NPCs退行性变造成的可能影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：8周龄雄性Sprague Dawley大鼠，SPF级，购自苏州大学实验动物中心。

1.1.2 试剂：DMEM:F12培养基、血清、青链霉素（美国Gibco），Ⅱ型胶原酶、FK866、NMN（美国Sigma-Aldrich），CCK8试剂（日本Dojindo），Trizol、NAD+/NADH检测试剂盒（中国碧云天），逆转录试剂盒（日本Takara），iTaq™Universal SYBR Green Supermix（美国Bio-Rad）。

1.1.3 仪器：酶标仪（美国Biotec），RT-PCR扩增仪、逆转录仪（美国Bio-Rad）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠尾椎NPCs分离：大鼠处死后离断尾部，消毒冲洗后剥脱皮肤及周围组织，逐级切开椎间盘，摘取髓核组织，胰酶37 ℃消化3 min，0.5% Ⅱ型胶原酶（1% FBS）37 ℃消化1 h。37 ℃ F12培养基（15% FBS）重悬后培养。

1.2.2 细胞培养：贴壁NPCs常规使用DMEM:F12完全培养基（10% FBS），37 ℃ 5% CO2恒温恒湿常氧培养箱培养，隔日更换培养基并观察细胞生长情况，至密度约80%时传代。

1.2.3 CCK-8法检测细胞增殖：选用对数生长期的NPCs，每孔3×103接种于96孔板培养24 h；分别用浓度梯度的FK866或NMN处理NPCs 12 h。避光CCK-8原液:F12培养基1:10混合（OD值基线），每孔加入120 µL，孵育2 h；酶标仪检测波长450 nm处各组及基线OD值。根据结果选择合理作用浓度范围。

1.2.4 分组给药干预：对数生长期的NPCs，按实验需求的密度进行种板并分组处理。FK866处理实验使用梯度浓度的FK866处理NPCs 12 h。NMN处理实验使用梯度浓度的NMN处理NPCs 12 h。挽救实验使用浓度50、100 µmol/L的FK866处理NPCs 12 h，更换使用梯度浓度NMN处理NPCs 12 h。

1.2.5 WST-8法检测细胞NAD含量：NPCs每孔2×105接种于6孔板干预处理。干预结束即吸弃培养基，加入200 µL的NAD+/NADH提取液，冰上裂解10 min，移至1.5 mL EP管后离心，吸取上层无色液体，获得总NAD样品。96孔板中加入NADH标准品及各组总NAD样品20 µL，乙醇脱氢酶工作液90 µL，37 ℃避光孵育10 min。每孔加入10 µL显色液，37 ℃避光孵育45 min，测量450 nm处OD值。计算各组对应的NAD或NADH浓度。

1.2.6 RT-PCR法检测细胞：NPCs每孔2×105接种于6孔板，分组处理。Trizol抽提总RNA，醇析法提纯。使用cDNA合成试剂盒逆转录获得cDNA，以GAPDH作为内参，RT-PCR检测Col2a1、Mmp3、Mmp13的表达水平。

本实验所用扩增用引物序列见表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.3 统计学处理方法 应用R软件进行统计分析校验，采用单因素方差分析，其中组间两两比较采取SNK-q检验，包括各组与基线、对照组与各处理组、各处理组之间的比照。P＜0.05视为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 FK866增加了NPCs的退行性变指标 为了确定FK866的浓度使用范围，确定FK866对细胞活力的直接影响，我们采用CCK8法进行了12 h FK866增殖毒性检测。与对照组相比，在1～200 µmol/L的浓度范围内，FK866对NPCs并无显著的增殖毒性，500µmol/L的FK866则显示出一定程度的增殖毒性（P＜0.05）（图1A）。我们使用FK866对NPCs进行了12 h处理。NAD测定结果显示，随着FK866浓度提升，NPCs的NAD含量降低（图1B）。RTPCR结果显示，在10 µmol/L组、20 µmol/L组与对照组之间各指标均并未显示出相关指标的表达差异；50 µmol/L组、100 µmol/L组及200 µmol/L组则显示Mmp3、Mmp13表达下调，Col2a1表达上调（图1C-E）。

图1 FK866增加了NPCs的退行性变指标Fig.1 FK866 increased the degradation index of NPC

2.2 NMN处理并未影响NPCs的退行性变水平 NMN浓度梯度处理NPCs。CCK8法12 h NMN对NPCs的增殖毒性检测结果显示，在0～1 000 µmol/L 的浓度范围内，NMN并未对NPCs显示出增殖毒性（图2A）。NAD测定显示，随着NMN浓度升高，NPCs内的NAD含量上升（图2B）。RT-PCR则显示各组退行性变指标基因表达差异均无统计学意义（图2C-E）。

图2 NMN处理并未影响NPCs的退行性变水平Fig.2 NMN treatment did not affect the degenerative level of NPCs

2.3 NMN对耗尽NAD的NPCs的挽救作用 浓度梯度NMN处理50、100 µmol/L FK866处理12 h后的NPCs 12 h。对于50 µmol/L FK866处理后的NPCs，NAD测定显示，随着NMN浓度升高，NPCs内的NAD含量上升（图3A）；RT-PCR显示，相较于无NMN组，较低浓度（10～50 µmol/L）组NPCs Col2a1表达上调；1 000 µmol/L组Mmp3、Mmp13表达上调，500 µmol/L、1 000 µmol/L组Col2a1表达下调，10 µmol/L、100 µmol/L、200 µmol/L组差异无统计学意义（图3B-D）。对于100 µmol/L FK866处理后的NPCs，NAD测定显示，随着NMN浓度升高，NPCs内的NAD含量上升（图3E）；RT-PCR显示，相较于无NMN组，较低浓度（10～50 µmol/L）组NPCs Col2a1表达显著上调，Mmp3表达下调，500µmol/L组及1 000 µmol/L组Mmp3、Mmp13表达上调，1 000 µmol/L组Col2a1表达下调，100 µmol/L及200 µmol/L表达差异无统计学意义（图3F-H）。

图3 NMN对耗尽NAD的NPCs的挽救作用Fig.3 The rescue effect of NMN on NPCs depleted of NAD

3 讨论

DDD是以IVDD为基础的以腰背痛为主要症状的疾病，目前针对DDD的保守治疗主要是减缓症状而非延缓或预防IVDD[1]。IVDD是一种涉及多种病因与病理生理过程的病理改变，其中髓核组织的退行性变被认为是关键的病理变化之一[2]。NPCs在衰老、外伤等各种病因作用下的功能与生物学行为改变，导致髓核形态与功能紊乱，最终导致了IVDD[1]。NPCs生理活动所需的NAD依赖NAMPT对烟酰胺的回收[1,4,8]。在病理条件下，NAD可被大量消耗，造成NAD含量过低而不足以维持正常的生理活动所需，NAD也可出现合成增加，含量升高，导致组织细胞功能紊乱；在多数衰老的组织内，NAMPT的表达水平降低，易出现NAD合成代谢功能障碍，但NAMPT也可因某些衰老相关通路的激活而出现表达升高，导致NAD合成增加[5,9-12]。根据本实验所示，FK866所造成的NAD的耗尽与退行性变水平存在一定的剂量反应关系；在给予一定浓度NMN后，则显示出挽救作用，但给予高浓度的NMN的挽救作用减弱乃至退行性变加重。仅NMN处理虽然增加了细胞内NAD的含量，但并没有对NPCs的退行性变造成显著影响。FK866的预先处理所导致的NAD耗尽可能改变了NPCs某些基因的表达或某些蛋白的活性，而导致在高NAD水平下出现不寻常的退行性改变。本研究表明，NPCs维持其正常功能有赖于NAD的代谢稳态：NAD的合成代谢障碍是IVDD可能的原因之一，使用NMN补充剂对于低NAD水平相关NPCs退行性变的治疗有一定的浓度区间。但在体内环境中，年龄相关IVDD是否可以通过摄入NMN挽救，尚待进一步研究；本实验中高浓度NMN的挽救作用消失甚至加重退行性变的原因也值得进一步研究。