青天葵中SKP1同源基因的克隆及原核表达

黎斯敏，左紫梅，詹若挺，何 瑞

广州中医药大学中药学院（中医药数理工程研究院）广州中医药大学中药资源科学与工程研究中心 岭南中药资源教育部 重点实验室 国家中成药工程技术研究中心南药研发实验室，广东 广州 510006

SKP1（S-phase kinase associated protein 1）蛋白在真核生物中普遍存在，其主要功能是结合F-box 蛋白和Cullin 蛋白形成SKP1-Cullin-F-box（SCF）复合体，参与生物体内蛋白质的泛素化降解过程[1]。经研究发现，多种SCF 复合体参与酵母和哺乳动物的众多重要生物过程[2]，除此之外，SCF 复合体还能影响植物的生长发育，如赤霉素[3]、生长素（Auxin）[4]、独脚金内酯（SLs）[5-6]和茉莉酸[7]等激素的信号转导过程和花的发育[8]、生物钟[9]、光信号[10]、细胞分裂过程[11]等。泛素化过程需要泛素激活酶（E1）、泛素结合酶（E2）和泛素连接酶（E3）的参与，其中E3 能特异性识别不同的底物。SCF 复合体是最常见的一类E3 泛素化连接酶[12]，一般由SKP1 蛋白、Cullin 蛋白、Rbxl 4 蛋白和F-box 蛋白组合而成[12]，其中SKP1 蛋白起到桥梁作用，能分别结合不同的F-box 和Cullin蛋白[13]。SKP1 蛋白由约170 个氨基酸残基组成，C端具有8 个α 螺旋结构（H1-H8），N 端具有的α/β 超二级结构类似于BTB/POZ 结构域的折叠方式[14]。SKP1 是一类较为保守的蛋白家族，该蛋白在人[15]和酵母[16]中都只有一个，但线虫中至少有21 个SKP1相关蛋白（SKR）[17]，且其表达模式、Cullin 和F-box蛋白结合方式上均有不同。SKP1在众多植物中都不止1 个成员，如拟南芥中预测得到21 个SKP1同源基因[18]。目前已从拟南芥Arabidopsis thaliana(L.) Heynh[19]、水稻Oryza sativaL.[20]、兰花CymbidiumL.[21]、烟草Nicotiana tabacumL.[22]、大豆Glycine max(Linn.) Merr.[23]、黄瓜Cucumis sativusL.[24]、草莓Fragaria×ananassaDuch.[25]等植物中克隆得到SKP1同源基因并对其功能进行了不同程度的研究，其中对拟南芥ASK1基因的研究较为深入。

青天葵又名独叶莲、珍珠草，来源于多年生兰科植物毛唇芋兰Nervilia fordii(Hance) Schltr.的叶或全草，具有清热润肺、解毒消肿等功效，主治肺痨咯血等疾病，临床上常用于治疗小儿呼吸道感染等肺部疾病[26]。由于青天葵生长环境要求较苛刻，且种子无胚乳，以无性繁殖为主，繁殖系数低。一般每年只生长1 片叶子，1～2 个块茎。过度采挖和生态环境恶化导致青天葵的野生资源日渐匮乏[27-29]。目前尚未有关于青天葵中SKP1基因的报道，而本课题组前期已获得青天葵转录组数据[30]，从中挖掘并克隆SKP1同源基因，有助于了解其参与青天葵的生长发育等方面的调控机制。

本研究从青天葵叶片中克隆得到5个SKP1同源基因NSKs，对其进行生物信息学分析，并将其连接至pGEX-4T-2 原核表达载体上，在大肠杆菌Rosetta（DE3）中进行诱导表达，经纯化得到融合蛋白，为后期进一步探讨NSKs 蛋白的功能提供基础。

1 材料、试剂及仪器

1.1 药材

所用植物材料青天葵为广西壮族自治区中医药研究院中药资源研究所黄云峰副研究员采集并鉴定为兰科植物毛唇芋兰N.fordii(Hance) Schltr.，于广州中医药大学中药资源科学与工程研究中心实验室培育。

1.2 菌种及载体

大肠杆菌Escherichia coli菌株E.coliDH5α 感受态细胞购自宝日医生物技术（北京）有限公司（TaKaRa）；pLB Vector 购自天根生化科技（北京）有限公司；Rosetta (DE3) Chemically Competent Cell购自上海唯地生物技术有限公司。

1.3 试剂

质粒小提试剂盒（TIANprep Mini Plasmid Kit）、pLB 零背景快速克隆试剂盒（Lethal Based Fast Cloning Kit）、通用型 DNA 纯化回收试剂盒（Universal DNA Purification Kit）、PrimeSTAR®Max DNA Polymerase、DNA Markers、PrimeScript RT reagent Kit 均购自宝日医生物技术（北京）有限公司（TaKaRa）；OminiPlant RNA Kit (DNase I) 购自北京康为世纪生物科技有限公司；PurKineTM谷胱甘肽S 转移酶标签蛋白纯化试剂盒（谷胱甘肽）购自Abbkine；Pageruler Prestained Protein Ladder 购自Thermo；ProteinFind® Anti-GST Mouse Monoclonal Antibody、ProteinFind® Goat Anti-Mouse IgG (H+L), HRP Conjugate 和EasySee® Super Western Blot Kit均购自北京全式金生物技术（TransGen Biotech）有限公司；液氮。

2 方法

2.1 青天葵叶片总RNA 的提取与cDNA 第一链的合成

参照OminiPlant RNA Kit （DNase I） 说明书提取青天葵叶片总RNA，用微量分光光度计测定其浓度和纯度，并用1%琼脂糖凝胶电泳检测叶片总RNA 的完整性。参照PrimeScript RT reagent Kit 说明书反转录得到cDNA。设计18 S rRNA 引物18 S-F、18 S-R 进行PCR 扩增，PCR 产物以1%琼脂糖凝胶电泳检测。

2.2 青天葵NSKs 基因编码区序列的克隆

将课题组前期建立的青天葵转录组注释的 Unigenes 数据库进行比对，筛选到5 条与拟南芥ASK1基因序列高度同源的Unigenes 序列。将这5条Unigenes 分别命名为NSK2、NSK3、NSK5、NSK7、NSK11。将NSK7和NSK11基因的碱基序列交由广州天一辉远基因科技有限公司进行全基因合成。同时设计基因特异性引物（表1），以“2.1”项下所得cDNA 为模板进行NSK2、NSK3、NSK5的开放阅读框（ORF）扩增，反应总体积为10 μL：cDNA 0.2 μL；引物F/R 各0.2 μL；PrimeSTAR 5 μL；ddH2O 4.4 μL。扩增程序：94 ℃、2 min；98 ℃、10 s，58 ℃、30 s，72 ℃、30 s，38 个循环；72 ℃、7 min。目的片段经回收纯化后连接至pLB Vector，转化至DH5α，经菌液PCR 鉴定后，挑取阳性菌株送广州天一辉远基因科技有限公司进行测序。

表1 所用引物Table 1 Primers used in this study

2.3 青天葵NSKs 蛋白的生物信息学分析

采用ExPASy-ProtParam 在线网站预测目的蛋白的相对分子质量、等电点等基本理化性质；分别用SOPMA 和SWISS-MODEL 预测蛋白质的二级结构和三级结构；采用Cell-PLoc 2.0 package 对蛋白进行亚细胞定位预测；利用NCBI 的BLASTP 和DNAMAN 对氨基酸序列进行同源检索和比对，应用软件MEGA7.0 构建系统进化树；用SignalP 4.1 Server 和TMHMM Server v 2.0 在线软件分别预测信号肽和跨膜结构域。

2.4 青天葵NSKs 原核表达载体构建、蛋白表达纯化及检测

2.4.1 原核表达载体构建 以“2.2”项下得到的含有NSK2、NSK3、NSK5、NSK7、NSK11 完整编码区序列质粒为模板，设计引物扩增目的基因片段（表1），反应总体积为100 μL：cDNA 2 μL；引物F/R各2.5 μL；PrimeSTAR 50 μL；ddH2O 43 μL。扩增程序：94 ℃、2 min；98 ℃、10 s，60 ℃、30 s，72 ℃、30 s，38个循环；72 ℃、7 min。目的片段经回收纯化后得到NSKs片段；为便于检测重组蛋白，用Infusion 酶将各NSK片段分别与经SalI 和EcoRI 双酶切后的pGEX-4T-2 载体连接。将连接产物转化至DH5α，经菌液PCR 鉴定后，挑取阳性菌株送广州天一辉远基因科技有限公司进行测序，测序正确后提取质粒。

2.4.2 蛋白表达纯化 将重组质粒转化大肠杆菌Rosetta（DE3）菌株，挑取单菌落于37 ℃过夜培养，用LB 液体培养基以1∶100 的比例扩大培养，振荡培养至A600达0.6～0.8，加入IPTG 至终浓度为0.2 mmol/L，转入16 ℃继续培养18 h。培养结束后离心收集菌体，每100 mL 菌液加入10 mL 磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4），按PurKineTM谷胱甘肽S转移酶（GST）标签蛋白纯化试剂盒说明书进行纯化，得到纯化蛋白。分别取20 μL 纯化蛋白，加入4×Loading buffer，100 ℃灭活10 min，用10%的分离胶进行SDS-PAGE 电泳检测。

2.4.3 Western Blot 检测 为了得到清晰的条带，将纯化得到的重组蛋白稀释一定比例，经SDS-PAGE 电泳后，利用湿转法将蛋白转移至已活化的Immobilon-E PVDF 转印膜，将膜置于封闭液（用TBST 缓冲液配制5%脱脂奶粉），于摇床上振荡孵育90 min；随后加入Anti-GST Mouse mAb（1∶5000）于4 ℃过夜孵育，用洗膜液（1×TBS 加入0.1%聚山梨酯-20）洗涤5 次。在室温条件下与Goat Anti-Mouse IgG/HRP（1∶10000）孵育1 h，再用洗膜液洗涤5 次，参照EasySee Western Blot Kit 说明书加入发光液，用全自动化图像分析系统进行拍照。

3 结果与分析

3.1 青天葵NSKs 基因的克隆

通过本地Blast 从青天葵转录组中筛选得到5条具有完整ORF 的NSKs序列，将其分别命名为NSK2、NSK3、NSK5、NSK7、NSK11。通过ORF Finder在线网站预测已知序列的ORF 片段，设计基因特异性引物进行扩增，克隆得到3 条NSKs基因，即NSK2、NSK3、NSK5，见图1。NSK7和NSK11基因由广州天一辉远基因科技有限公司合成。

图1 青天葵叶片总RNA (A) 和cDNA 的18S (B) 及NSKs(C) 扩增琼脂糖凝胶电泳图Fig.1 Agarose gel electrophoresis of total RNA of N.fordii leaves (A), 18S (B), and NSKsamplified from cDNA (C)

3.2 青天葵NSKs 蛋白的生物信息学分析

3.2.1 青天葵NSKs 蛋白的基本理化性质、功能域预测和亚细胞定位预测 采用ExPASy-ProtParam 在线工具对NSKs 蛋白的基本理化性质进行分析，结果表明，NSK2、NSK3、NSK5均为不稳定的亲水蛋白，而NSK7和NSK11 是稳定的疏水蛋白，见表2。

Cell-PLoc 2.0 package 在线软件对NSKs 的亚细胞定位预测表明NSK2、NSK3、NSK5 均定位于细胞核，而NSK7 和11 定位于细胞质和细胞核。利用NCBI 预测NSKs 蛋白的保守功能结构域，发现NSK2、NSK3、NSK5、NSK7 和NSK11 均具有F-box、Cullin 蛋白的结合位点，且 N 端均具有类似BTB/POZ 折叠的约120 个氨基酸残基的α/β 结构。

3.2.2 青天葵NSKs 蛋白的高级结构、信号肽和结构域分析 用SOPMA 在线软件对NSKs 蛋白进行二级结构预测，发现5 个蛋白的二级结构主要由四种形式组成，其中NSK3、NSK5、NSK7 和NSK 11中均是α-螺旋（alpha helix）＞无规卷曲（random coil）＞延伸链（extended strand）＞β 转角（beta turn），而NSK2 的β 转角＞延伸链，见表3。

用SWISS-MODEL 进行NSKs 蛋白建模，结果表明，NSK2、NSK3 和NSK5 的蛋白三级结构高度相似，而NSK7 和NSK11 的蛋白三级结构较为不同。前三者的模板为茉莉酸信号中的Coronatine-insensitiveprotein 1 和SKP1-like protein 1A、JAZ1 incomplete degron peptide 的复合体结构，一致性均在75%左右，相似性均为 0.54；NSK7 参考模板是 S-phase kinase-associated protein 1 蛋白与F-box/LRRs -repeat protein 17 和Kelch-like ECH-associated protein 1 的复合体结构，一致性为67.3%，相似性为0.5；NSK11参考模板为人的S-phase kinase-associated protein 1蛋白模型，一致性均为61.78%，相似性均为0.49；具体信息见图2。

表2 青天葵NSKs 基本理化性质Table 2 Physical and chemical properties of NSKs proteins from N.fordii

表3 青天葵NSKs 蛋白的二级结构信息Table 3 Secondary structure information of NSK proteins from N.fordii

图2 青天葵NSKs 蛋白的三级结构预测Fig.2 Prediction of three-dimensional structures of NSK proteins from N.fordii

根据SignalP 4.1 Server 在线软件预测结果可知，NSK2、NSK3、NSK5、NSK7、NSK11 的信号肽平均值分别为0.000 6、0.000 8、0.000 6、0.000 6和0.001 3，均不具有信号肽及切割点，为非分泌蛋白。利用TMHMM Server v2.0 在线软件对NSKs 蛋白的跨膜结构域进行分析，结果表明三者均为膜外蛋白，无跨膜区。

3.2.3 青天葵NSKs 蛋白的同源比对及亲缘进化树分析 用DNAMAN 比对NSK2、NSK3、NSK5、NSK7、NSK11 的蛋白序列，发现5 者的同源性达到73.65 %。用NCBI 对NSKs 蛋白进行蛋白序列同源性检索，选出同源性较高 SKP1 同源蛋白用MEGA 7.0 对其进行分析（图3）。结果发现青天葵NSK2、NSK3 和NSK5 聚为一簇，与小麦和玉米等的同源性较高，而NSK7 和NSK11 聚为一簇，与多头绒泡菌的同源性较高。研究表明，尽管SKP1 蛋白广泛存在于真核生物中，但该蛋白在进化上具有一定的保守性[19]。

图3 不同植物中SKP1 蛋白系统进化树Fig.3 Phylogenetic tree of SKP1 proteins from different plants

3.3 GST-NSKs 融合蛋白的表达纯化

根据目的片段设计特异性引物扩增得到单一条带，菌落PCR 及测序结果表明基因NSK2、NSK3、NSK5、NSK7、NSK11成功插入到pGEX-4T-2 载体中（图4）。将重组质粒转化至 Rosetta（DE3）感受态中，经 IPTG 诱导表达GST 融合蛋白，用PurKineTM 谷胱甘肽S 转移酶标签蛋白纯化试剂盒纯化得到较纯的 NSKs重组蛋白。

图4 NSKs 原核表达载体构建Fig.4 Construction of prokaryotic expression vectors of NSKs fused with GST-tag

SDS-PAGE 凝胶电泳结果如图5 所示，5 者均在约50 000 处出现目的蛋白。Western Blot 结果表明，纯化的GST-NSKs 蛋白的条带大小与预期的蛋白大小相符。

图5 重组GST-NSKs 蛋白的纯化及Western blot 检测Fig.5 Purification of recombinant GST-NSK proteins and Western blot analysis

4 讨论

SKP1基因广泛存在于植物中，且植物中一般会存在多个SKP1基因。如拟南芥中有21 个表达模式和功能差异较大的SKP1同源基因（ASK1～ASK21），序列高度相似的ASK基因的表达水平和方式较为相似，部分ASK基因定位于核内[18]。而单子叶植物水稻中也发现了18 个SKP1同源基因，从中克隆得到OSK1、OSK2、OSK3基因，OSK1是水稻内具有管家功能的SKP1基因，而OSK2和OSK3则可能具有与OSK1不同的功能[20]。本研究从青天葵中克隆得到5 个SKP1同源基因，5 者相似性高达73.65%。亚细胞定位预测结果与已发现的SKP1基因一致，均能在细胞核内表达。而三级结构预测及亲缘进化树结果均表明，NSK2、NSK3 和NSK5和玉米、小麦等单子叶植物的同源性较高，而NSK7和NSK11 与多头绒泡菌聚为一簇，但二者的三级结构较为不同。以上结果均表明，NSKs编码SKP1 类蛋白，可能具有参与SCF 复合体的形成从而调控植物的生长发育的功能。在SCF 复合体的形成中NSK2、NSK3 和NSK5 蛋白的功能可能是相似的，而NSK7 和NSK11 的功能可能有些不同，还需进一步研究。

SKP1 蛋白能与F-box 蛋白结合，即结合不同激素信号受体蛋白结合形成多种SCF 复合体从而参与生长素、茉莉酸、独脚金内酯等植物激素的信号传导过程[19]。如拟南芥中的ASK1 和ASK2 能分别与拟南芥的生长素受体TIR1 蛋白和拟南芥的茉莉酸受体COI1 蛋白互作形成SCF 复合体，而ASK11 和ASK12以及小粒水稻OmSKP1 也能与COI1 互作形成SCF复合体与泛素-蛋白酶体途径蛋白降解[31-35]。此外，ASK1 与ORE9/MAX2 蛋白互作及水稻OSK1、OSK5、OSK20 与OsD3 互作从而参与独脚金内酯信号的传导[5,36]。如上所述，SKP1 类蛋白能与不同的F-box 蛋白结合，有些SKP1 蛋白能与多种F-box蛋白结合，但结合作用强弱有所不同，而有些SKP1蛋白至今未能找到与其互作的F-box 蛋白[33,37]。本研究建立了适用于携带GST 标签的NSKs 蛋白的原核诱导表达条件，经Western Blot 检测表明成功诱导并纯化得到可溶性良好的、携带GST 标签的NSKs 蛋白，后期可用于Pulldown 实验验证与之互作的F-box 蛋白。试验中发现GST-NSK5 融合蛋白的表达量较另外4 者的低，可能是诱导时间不够，后期蛋白功能验证试验可适当延长诱导时间，以提高目的蛋白的表达水平，获得足量的蛋白。有学者从黄瓜中克隆得到Skp1基因并纯化得到Skp1蛋白，利用该蛋白制备的抗血清能从黄瓜中提取得到的蛋白中检测出Skp1 蛋白[24]。这为研究青天葵中NSKs蛋白功能提供了一定的研究思路，可进一步通过纯化得到的NSKs 蛋白制备目的蛋白的特异抗体，检测青天葵原植物中NSKs 的蛋白表达情况等。本研究表明从青天葵中克隆得到的5 个NSKs基因具有一定的保守性，五者在SCF 复合体中发挥的功能有待后续的深入研究验证。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突