三尖杉茎叶中的二萜类化合物研究

张 鑫，王景丽，赵春雪，姜春宇，景沁雪，袁艺珍，李达翃，李占林，华会明，白 皎

沈阳药科大学中药学院 天然药物化学教研室，辽宁 本溪 117004

三尖杉Cephalotaxus f ortuneiHook.f.为三尖杉科三尖杉属植物，我国特有树种，主产于我国南方[1]。三尖杉味苦、涩，性平、微寒，我国传统医药中主要应用于驱虫、止咳、润肺，现代医学中主要用于治疗白血病和恶性淋巴瘤等[2]。药理学研究表明，三尖杉中的三尖杉酯碱类化合物对急性非淋巴细胞性白血病和慢性粒细胞白血病有较好疗效，三尖杉酯碱和高三尖杉酯碱在我国已被开发成抗癌药物[3]。近几年研究表明，三尖杉中的环庚三烯酮类降二萜类化合物也有很强的细胞毒活性[4-6]。为了更好地开发利用三尖杉植物资源，本实验对三尖杉茎叶75%乙醇提取物的化学成分进行研究，从其二氯甲烷萃取部位分离得到10 个二萜类化合物，分别鉴定为12,16-二羟基松香烷-6,8,11,13-四烯-3-酮（1）、桧醇（hinokiol，2）、柳杉酚（sugiol，3）、margoclin（4）、cephafortoid B（5）、torreyayunnin（6）、贡山三尖杉二萜 D（lanceolatin D，7）、6α-羟基山达海松酸（6α-hydroxy sandaracopimaric acid，8）、海南粗榧内酯（hainanolide，9）、海南粗榧内酯醇（hainanolidol，10）。化合物1 为新化合物，化合物4、8 为首次从三尖杉属植物中分离得到。

1 仪器与材料

BS124S 电子分析天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；SB-35 型旋转蒸发仪（上海爱朗有限公司）；101-1BS 恒温鼓风干燥箱 [邦西仪器科技（上海）有限公司]；Shimadzu UV-1700 型紫外光谱仪[岛津仪器（苏州）有限公司]；Perkin-Elmer 241 MC polarimeter 型旋光测定仪（美国Perkin-Elmer 公司）；Bruker-600M-AVIII-型核磁共振波谱仪（美国Bruker公司）；6450-UHD-accurate-Mass-Q-TOF-MS 型高分辨质谱仪（美国Agilent 公司）；Hitachi L-6000 型高效制备液相色谱仪；YOKO-CS 薄层色谱紫外检测器（武汉药科新科技公司）；HP20 大孔树脂（美国Supelco 公司）；ODS 柱色谱填料（GE Heaithcare公司）；Sephadex LH-20（GE Heaithcare 公司）；氘代试剂 CDCl3及 DMSO-d6（Cambridge Isotope Laboratories Inc.）；柱色谱硅胶及薄层色谱硅胶（青岛海洋化工厂）；色谱甲醇（天津市康科德科技有限公司）；色谱乙腈（山东禹王和天下新材料有限公司）；其他所有溶剂均为分析纯（天津市富宇精细化工有限公司）。

三尖杉茎叶购于安徽真源堂药业有限公司，产于安徽南部，经沈阳药科大学中药学院袁久志副教授鉴定为三尖杉Cephalotaxus fortuneiHook.f.。

2 提取与分离

取三尖杉茎叶45.8 kg，用75%工业乙醇浸泡后回流提取3 次，每次2 h，合并提取液，浓缩得到浸膏共6.45 kg。将浸膏悬浮于水，加入2%的稀盐酸调节至pH 值2～3，溶液滤过，得到沉淀。将上述的沉淀物用水悬浮，并加入无水碳酸钠调节pH 至中性，分别用二氯甲烷、醋酸乙酯和正丁醇萃取，浓缩干燥后得到二氯甲烷萃取物A（105 g）、醋酸乙酯萃取物B（100 g）和正丁醇萃取物C（300 g）。将二氯甲烷萃取物A（105 g）用硅胶柱色谱进行分离，以二氯甲烷-甲醇（100∶0～0∶100）为洗脱剂进行梯度洗脱，结合薄层色谱检识合并，得到7 个组分（Fr.a1～a7）。Fr.a1 经二氯甲烷重结晶得到化合物3（8.5 mg）。Fr.a2 经过HP20 大孔树脂除去色素，经硅胶开放柱色谱，采用石油醚-醋酸乙酯（100∶0～0∶100）洗脱，得到8 个亚组分（Fr.a2-1～a2-8），其中Fr.a2-2 经Sephadex LH-20 柱色谱（甲醇）纯化及重结晶（甲醇）得到化合物6（10.8 mg）；Fr.a2-5 经半制备高效液相色谱（59%乙腈）纯化得到化合物2（6.5 mg，tR＝58 min）。Fr.a3 经过HP20大孔树脂除去色素，经硅胶开放柱色谱，二氯甲烷-甲醇（100∶0～0∶100）洗脱，得到7 个亚组分（Fr.a3-1～a3-7），其中Fr.a3-1 经Sephadex LH-20 柱色谱（甲醇）得2 个组分（Fr.a3-1-1、Fr.a3-1-2），Fr.a3-1-1 经甲醇重结晶得化合物9（20.9 mg）；Fr.a3-1-2 经半制备高效液相色谱（68%甲醇）纯化得到化合物10（22.7 mg，tR＝22 min）；Fr.a3-5 经半制备高效液相色谱（65%甲醇）纯化得到化合物1（13.8 mg，tR＝46 min）；Fr.a3-7 经Sephadex LH-20柱色谱（甲醇）得到了化合物8（5.3 mg）。Fr.a4经过HP20 大孔树脂除去色素，经ODS 开放柱色谱分离（20%～100%甲醇），得到7 个亚组分（Fr.a4-1～a4-7），其中Fr.a4-4 经Sephadex LH-20 柱色谱（甲醇）得化合物5（3.3 mg）；Fr.a4-5 和Fr.a4-7分别经Sephadex LH-20 柱色谱（甲醇）与半制备高效液相色谱（50%甲醇和63%甲醇）纯化分别得到化合物7（5.1 mg，tR＝32 min）和4（12.1 mg，tR＝43 min）。

3 结构鉴定

化合物1：白色针状结晶（甲醇），[α]20D-45.2 (c1.0, MeOH)。紫外254 nm 下呈暗斑，365 nm 下呈黄色荧光，10%硫酸乙醇试剂显紫色。UV (MeOH)显示最大吸收峰λmax(logε)：281 (0.44)，207 (1.12)，248 (0.20) nm。HR-ESI-MS 显示准分子离子峰m/z313.178 5 [M－H]-，结合氢谱和碳谱数据确定分子式为C20H26O3，不饱和度为8。

1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6) 谱（表1）显示2 个芳香质子信号δ6.83 (1H, s, H-14), 6.65 (1H, s, H-11)，推测为苯环的对位质子；2 个顺式偶合烯氢质子信号δ6.54 (1H, dd,J =9.6, 3.0 Hz, H-7), 5.76 (1H, dd,J =9.6, 2.6 Hz, H-6)；δ3.55 (1H, dd,J= 10.2, 5.6 Hz, H-16), 3.35 (1H, dd,J =10.2, 7.7 Hz, H-16)，提示存在羟甲基。13C-NMR (150 MHz, DMSO-d6) 谱（表1）给出20 个碳信号，其中δ214.4为酮羰基碳信号，δ154.9, 144.7, 128.5, 128.1, 125.8, 124.4, 123.6, 109.3 为芳碳或烯碳信号，提示存在1个苯环和1 个双键，其中δ154.9 为连氧芳碳信号；δ65.6, 50.9, 46.5, 36.8, 34.6, 34.4, 34.3, 24.7, 22.2, 19.8, 17.1 为脂肪碳信号，其中δ65.6 为连氧碳信号。由此推断该化合物为松香烷二萜类化合物。详细比较化合物1 与已知化合物5（cephafortoid B）的1H-和13C-NMR 数据发现，C 环和侧链部分基本一致，主要差别在A 环和B 环上，化合物1 相比于cephafortoid B，少了2 个脂肪碳信号，多了1 组双键信号δH6.54 (1H, dd,J= 9.6, 3.0 Hz, H-7),δC128.5；δH5.76 (1H, dd,J= 9.6, 2.6 Hz, H-6),δC124.4。

表1 化合物1 的核磁数据 (600/150 MHz, DMSO-d6)Table 1 NMR data of compound 1 (600/150 MHz, DMSO-d6)

在1H-1H COSY 谱中可以观察到3 个自旋耦合系统：C1-C2、C5-C6-C7、C16-C15-C17。在HMBC谱中，亚甲基质子信号δ2.30 (1H, ddd,J= 15.3, 14.4, 6.1 Hz, H-1), 2.34 (1H, ddd,J= 15.5, 4.6, 2.8 Hz, H-2), 2.90 (1H, m, H-2) 以及2 个甲基质子δ1.17 (3H, s, 19-CH3), 1.04 (3H, s, 18-CH3) 分别与羰基碳δ214.4 相关，确定了羰基在C-3 位。烯氢质子信号δ5.76 (1H, dd,J= 9.6, 2.6 Hz, H-6) 与C-4 (δ46.5)、C-5 (δ50.9)、C-7 (δ128.5) 相关，δ6.54 (1H, dd,J= 9.6, 3.0 Hz, H-7) 与C-5 (δ50.9)、C-6 (δ124.4)、C-9 (δ144.7)、C-11 (δ109.3)、C-14 (δ125.8) 相关，芳香质子信号δ6.83 (1H, s, H-14) 与C-7 (δ128.5)、C-9 (δ144.7)、C-12 (δ154.9)、C-15 (δ34.6) 相关，确定双键位于C-6和C-7位；具体1H-1H COSY和HMBC 相关见图1。

图1 化合物1 的结构式及主要 1H-1H C OSY (粗线) 和HMBC (箭头) 相关Fig.1 Structure and key 1H-1H COSY, HMBC correlations of compound 1

从NOESY 谱（图2）中，CH3-18 和H-5 相关，表明CH3-18，H-5 在同侧，定为α 朝向；CH3-19和CH3-20 相关，证明CH3-19，CH3-20 在同侧，定为β 朝向；由于苯环将13 位的羟基异丙基与A/B环隔离开，无NOESY 相关信号，暂未确定其侧链的构型。

图2 化合物1 的主要的NOESY 相关Fig.2 Key NOESY correlations of compound 1

综上所述，化合物1 的结构确定为12,16-二羟基松香烷-6,8,11,13-四烯-3-酮，经文献检索，该化合物为未见文献报道的新化合物。化合物的1H 和13C-NMR 谱信号归属及HMBC 相关见表1。

化合物2：无色针状结晶（甲醇），[α]20D＋170.0 (c0.08, MeOH)。紫外254 nm 下呈暗斑，365 nm 下黄色荧光，10%硫酸乙醇试剂显紫色。1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6)δ:8.78 (1H, s, 12-OH), 6.69 (1H, s, H-14), 6.60 (1H, s, H-11), 4.42 (1H, d,J= 5.1 Hz, 3-OH), 1.10 (3H, d,J= 6.9 Hz), 1.09 (3H, d,J= 6.9 Hz), 1.07 (3H, s, 18-CH3), 0.96 (3H, s, 19-CH3) ,0.76 (3H, s, 20-CH3)；13C-NMR (150 MHz, DMSO-d6)δ:152.2 (C-12), 147.2 (C-9), 131.5 (C-13), 125.8 (C-14), 124.6 (C-8), 110.4 (C-11), 76.7 (C-3), 49.0 (C-5), 38.6 (C-4), 36.9 (C-1, 10), 29.7 (C-7), 28.3 (C-19), 27.8 (C-2), 26.1 (C-15), 24.8 (C-20), 22.7 (C-17), 22.5 (C-16), 18.9 (C-6), 15.8 (C-18)。以上数据与文献NMR 数据对照一致[7]，故鉴定化合物2 为桧醇。

化合物3：无色针状结晶（甲醇），紫外灯下254 nm 呈暗斑，365 nm 呈黄色荧光，10%硫酸乙醇显紫色。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ:10.25 (1H, s, 12-OH), 7.64 (1H, s, H-14), 6.78 (1H, s, H-11), 3.13 (1H, sept,J= 7.0 Hz, H-15), 1.15 (3H, s, 20-CH3), 1.14 (3H, d,J= 7.0 Hz, 16-CH3), 1.12 (3H, d,J= 7.0 Hz, 17-CH3), 0.94 (3H, s, 19-CH3), 0.88 (3H, s, 18-CH3)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6)δ:196.4 (C-7), 160.2 (C-12), 155.9 (C-9), 132.7 (C-13), 125.2 (C-14), 122.8 (C-8), 109.4 (C-11), 49.2 (C-5), 40.7 (C-3), 40.1 (C-10), 37.4 (C-1), 35.4 (C-6), 32.7 (C-4), 32.2 (C-18), 25.9 (C-15), 22.9 (C-20), 22.2 (C-17), 22.1 (C-16), 21.0 (C-19), 18.4 (C-2)。以上数据与文献的NMR 数据对照一致[8]，故鉴定化合物3 为柳杉酚。

化合物4：无色针状结晶（甲醇），紫外灯下254 nm 呈暗斑，365 nm 呈浅黄色荧光，10%硫酸乙醇显棕色。1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6)δ:10.18 (1H, s, 12-OH), 7.64 (1H, s, H-14), 6.76 (1H, s, H-11), 4.53 (1H, s, 3-OH), 2.58 (1H, dd,J= 17.8, 3.4 Hz, H-1), 2.43 (1H, dd,J= 17.8, 3.4 Hz, H-1), 1.13 (9H, m, 16, 17, 18-CH3), 0.93 (3H, s, 19-CH3), 0.83 (3H, s, 20-CH3)；13C-NMR (150 MHz, DMSO-d6)δ: 196.6 (C-7), 160.1 (C-12), 155.4 (C-9), 132.6 (C-13), 124.9 (C-14), 122.4 (C-8), 109.5 (C-11), 76.0 (C-3),48.3 (C-5), 38.4 (C-4), 37.2 (C-10), 35.8 (C-1), 35.3 (C-6), 27.4 (C-2), 27.4 (C-4), 26.0 (C-15), 23.0 (C-20), 22.4 (C-17), 22.2 (C-16), 15.3 (C-19)。与文献的NMR 数据对照一致[9]，故鉴定化合物4 为margoclin。

化合物5：无色针状针晶（甲醇），[α]20D-11.6 (c0.3, MeOH)。紫外灯下254 nm 呈紫色暗斑，365 nm呈浅黄色莹光，10%硫酸乙醇试剂显棕色。1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6)δ:10.26 (1H, s, 12-OH), 7.61 (1H, s, H-14), 6.76 (1H, s, H-11), 4.53 (1H, s, 3-OH), 3.55 (1H, dd,J =10.2, 5.7 Hz, H-3), 3.10 (2H, m, H-16), 2.56 (1H, dd,J =17.8, 14.1 Hz, H-6), 2.43 (1H, dd,J =17.8, 3.4 Hz, H-6), 1.14 (3H, s, 18-CH3), 1.11 (3H, d,J =7.0 Hz, 17-CH3), 0.93 (3H, s, 20-CH3), 0.83 (3H, s, 19-CH3)；13C-NMR (150 MHz, DMSO-d6)δ:196.6 (C-7), 160.7 (C-12), 155.5 (C-9), 129.2 (C-13), 126.5 (C-14), 122.2 (C-8), 109.7 (C-11), 75.9 (C-3), 65.4 (C-16), 48.4 (C-5), 38.5 (C-4), 37.2 (C-10), 35.8 (C-15), 35.3 (C-1), 34.5 (C-6), 27.5 (C-2), 27.4 (C-18), 23.1 (C-20), 16.9 (C-17), 15.3 (C-19)。与文献的NMR 数据对照一致[10]，故鉴定化合物5 为cephafortoid B。

化合物6：白色针状结晶（甲醇），[α]20D＋92.1 (c0.95, MeOH)。紫外灯下254 nm 呈暗斑，365 nm 呈黄色荧光，10%硫酸乙醇试剂显紫色。1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6)δ:8.78 (2H, m, 11, 12-OH), 7.38 (1H, s, H-14), 1.15 (3H, d,J= 6.9 Hz, 17-CH3), 1.13 (3H, d,J= 6.9 Hz, 16-CH3), 1.07 (3H, s, 18-CH3), 1.06 (3H, s, 19-CH3) ；13C-NMR (150 MHz, DMSO-d6)δ:215.5 (C-3), 196.5 (C-7), 148.9 (C-12), 143.0 (C-11), 137.3 (C-9), 133.5 (C-13), 123.5 (C-8), 115.9 (C-14), 48.6 (C-5), 46.4 (C-4), 38.3 (C-10), 35.5 (C-6), 35.1 (C-1), 34.1 (C-2), 26.5 (C-15), 26.0 (C-18), 22.6 (C-16), 22.5 (C-17), 20.4 (C-19), 17.3 (C-20)。与文献的NMR 数据对照一致[11]，故鉴定化合物6 为torreyayunnin。

化合物7：白色针状结晶（甲醇），[α]20D-40.0 (c0.37, MeOH)。紫外灯下254 nm 呈暗斑，365 nm 呈黄色荧光，10%硫酸乙醇试剂显紫色。1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6)δ:8.50 (1H, s, 11-OH), 6.63 (1H, s, H-14), 4.27 (1H, d,J= 8.9 Hz, H-20), 3.63 (3H, s, 12-OCH3), 3.50 (1H, dd,J= 10.1, 6.2 Hz, H-16), 3.36 (1H, dd,J= 10.1, 7.7 Hz, H-16), 3.08 (1H, dd,J= 8.9, 1.5 Hz, H-20), 1.22 (3H, s, 18-CH3), 1.12 (3H, d,J= 7.1 Hz, 17-CH3), 0.88 (3H, s, 19-CH3)；13C-NMR (150 MHz, DMSO-d6)δ: 215.3 (C-3), 145.6 (C-12), 144.2 (C-11), 136.2 (C-8), 135.5 (C-13), 127.8 (C-9), 112.6 (C-14), 69.7 (C-7), 67.5 (C-20), 66.5 (C-16), 61.1 (12-OCH3), 47.0 (C-4), 42.1 (C-5), 38.5 (C-10), 35.3 (C-2), 34.4 (C-15), 28.4 (C-6), 26.8 (C-1), 24.4 (C-18), 20.4 (C-19), 18.3 (C-17)。与文献的NMR 数据对照一致[12]，故鉴定化合物7 为贡山三尖杉二萜D。

化合物8：无色针状结晶（甲醇），[α]20D-6.5 (c0.3, MeOH)。10%硫酸乙醇试剂显棕色。1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6)δ: 12.01 (1H, s, 19-COOH), 4.60 (1H, s, 6-OH), 5.74 (1H, dd,J= 17.5, 10.6 Hz, H-15), 5.20 (1H, s, H-14), 4.88 (1H, dd,J= 17.5, 1.4 Hz, H-16b), 4.87 (1H, dd,J= 10.6, 1.5 Hz, H-16a), 3.80 (1H, d,J= 9.6 Hz, H-6), 0.99 (3H, s, 18-CH3), 0.97 (3H, s, 17-CH3), 0.74 (3H, s, 20-CH3)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6)δ:178.6 (C-19), 148.4 (C-15), 136.1 (C-8), 128.7 (C-14), 110.5 (C-16), 74.0 (C-6), 52.7 (C-10), 49.8 (C-5), 49.5 (C-9), 37.1 (C-13), 37.0 (C-4), 36.5 (C-1), 34.9 (C-7), 33.9 (C-12), 27.2 (C-11), 25.9 (C-17), 23.9 (C-3), 18.3 (C-2), 14.8 (C-20), 11.4 (C-18)。与文献的NMR 数据对照一致[13]，故鉴定化合物8 为6α-羟基山达海松酸。

化合物9：无色针状结晶（甲醇），紫外灯下254 nm 呈暗斑，10%硫酸乙醇显紫色。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ: 6.82 (1H, s, H-10), 6.80 (1H, s, H-2), 5.36 (1H, d,J= 5.5 Hz, H-5), 5.24 (1H, t,J= 5.6 Hz, H-15), 3.94 (1H, d,J= 5.6 Hz, H-16), 3.37 (1H, m, H-11), 2.87 (1H, m, H-11), 2.58 (2H, m, H-12), 2.29 (3H, d,J= 0.8 Hz, 19-CH3), 0.73 (3H, d,J= 7.6 Hz, 18-CH3)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6)δ: 185.3 (C-1), 173.4 (C-17), 146.2 (C-9), 145.6 (C-8), 145.5 (C-4), 143.6 (C-3), 140.0 (C-10), 138.2 (C-2), 85.7 (C-16), 79.6 (C-5), 78.8 (C-15), 48.9 (C-7), 45.2 (C-13), 41.4 (C-6), 39.9 (C-14), 31.3 (C-11), 23.1 (C-19), 21.8 (C-12), 14.4 (C-18)。与文献的NMR 数据对照基本一致[4]，故鉴定化合物9 为海南粗榧内酯。

化合物10：无色针状结晶（甲醇），紫外灯下254 nm 呈暗斑，10%硫酸乙醇显紫色。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ: 6.79 (1H, s, H-10), 6.72 (1H, s, H-2), 5.56 (1H, d,J= 3.8 Hz, 15-OH), 4.52 (1H, t,J= 4.2 Hz, H-16), 3.48 (3H, m, H-15, 7), 3.48 (1H, m, H-11), 3.11 (1H, dd,J= 18.3, 11.3 Hz, H-5), 2.96 (1H, m, H-11), 2.78 (1H, m, H-12), 2.58 (1H, m, H-12), 2.16 (1H, m, H-5), 2.14 (3H, d,J= 0.8 Hz, 19-CH3), 1.74 (1H, m, H-6), 1.34 (1H, m, H-14), 0.84 (3H, d,J= 7.1 Hz, 18-CH3)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6)δ: 184.7 (C-1), 175.1 (C-17), 147.3 (C-9), 145.7 (C-8), 144.6 (C-4), 142.2 (C-3), 139.5 (C-10), 137.0 (C-2), 77.7 (C-16), 74.5 (C-15), 50.6 (C-7), 43.9 (C-13), 37.0 (C-14), 36.8 (C-6), 33.6 (C-5), 29.6 (C-11), 24.3 (C-12), 21.3 (C-19), 16.7 (C-18)。与文献的NMR 数据对照一致[14]，故鉴定该化合物为海南粗榧内酯醇。

4 讨论

本课题从三尖杉干燥茎叶的75%工业乙醇提取物分离鉴定了10 个二萜类化合物，包括7 个松香烷类二萜、1 个海松烷类二萜和2 个环庚三烯酮降二萜类化合物。其中化合物1 为未见文献报道的新化合物，化合物4、8 首次从三尖杉属植物中分离得到。松香烷二萜类化合物广泛分布于自然界主要存在于松柏类植物和微生物中，本研究分离得到的桧醇、柳杉酚等具有一定的抗溃疡和抗菌活性[16]；环庚三烯酮降二萜类化合物为三尖杉属所特有，是具有多环稠合结构的高刚性化合物，结构新颖，具有显著的抗癌活性。其中海南粗榧内酯对L615 白血病细胞、S180肉瘤瘤细胞、W256Walker 癌细胞、Lewis 肺癌细胞、P388 白血病细胞和L1210 白血病细胞均有较好抑制活性[15]。本研究对阐明三尖杉的物质基础有一定的意义，为三尖杉属植物资源的开发利用以及植物化学分类学提供科学依据。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突