经典名方竹叶石膏汤的物质基准量值传递分析

葛 威，刘小康，王康宇，郭云龙，蔡广知，赵跃刚，贡济宇

长春中医药大学药学院，吉林 长春 130117

竹叶石膏汤（Zhuye Shigao Decoction，ZSD）源自东汉·张仲景《伤寒论》，具有丰富的临床应用基础，是国家中医药管理局发布的《古代经典名方目录（第一批）》所载方剂之一[1]，由淡竹叶、石膏、麦冬、人参、甘草、半夏及粳米7 味中药组成，具有清气分热、清热生津、益气和胃之功效，主治伤寒、温病、暑病余热未清，气津两伤证。其中，淡竹叶、石膏清热除烦为君药，人参、麦冬益气养阴为臣药，半夏降逆止呕为佐药，甘草、粳米调养胃气为使药。现代临床常将其用于治疗各种传染病热病[2-7]。

经典名方是中医药数千年临床实践的结晶，具有组方合理、疗效确切、安全性高等特点，为中医药的精髓所在，然而研究成功的关键在于能否研制出符合质量要求的古代经典名方物质基准[8-12]。ZSD 中所含药味较多，化学成分复杂，在一些成分尚未明确的前提下，选择特征图谱、含量测定结合化学模式识别法能更好地评价其质量的一致性和优劣性[13-14]，本实验以ZSD 为研究对象，基于饮片-物质基准之间的量值传递开展研究，探寻ZSD 中的关键质量属性转移规律，初步确定物质基准出膏率的质量控制范围、定量指标及其转移率范围，以期为石膏汤物质基准的质量控制及后续制剂开发提供借鉴。

1 仪器与材料

1.1 仪器

LC-2030 型高效液相色谱仪，包括DGC-20A型在线脱气系统，SIL-20A 型自动进样系统，UV检测器，日本岛津公司；AB135-S 型十万分之一电子天平、AL204 型万分之一电子天平，瑞士梅特勒-托利多公司；KES-W22CS208H 型电陶炉，深圳市康佳智能电器科技有限公司；KQ-500E 型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；SCIENTZ-12N 型冷冻干燥机，宁波新芝生物科技股份有限公司；TGL16E 台式高速冷冻离心机，长沙英泰仪器有限公司。

1.2 试药

对照品异荭草苷、荭草苷、牡荆素，购自上海源叶生物科技有限公司，批号B21528、B20509、B20875，质量分数均大于98%；对照品人参皂苷Rg1、Re、Rb1，购自中国食品药品检定研究院，批号110703-201731、110754-201626、110704-201726，质量分数依次为98.4%、97.4%、98.2%；对照品甘草苷、甘草酸、异甘草苷、甘草素，购自上海源叶生物技术有限公司，批号551-15-5、1405-86-8、578- 86-9、961-29-5，质量分数均大于98%；乙腈、磷酸、甲醇，Thermo Fisher，色谱级；屈臣氏蒸馏水，广州屈臣氏食品饮料有限公司。

淡竹叶、石膏、麦冬（去心）、半夏、人参、甘草药材均来自神威药业集团有限公司，饮片均为实验室按照原方记载及相关法规炮制[15]。各药材经长春中医药大学中药鉴定教研室蔡广知副教授鉴定，淡竹叶为禾本科淡竹叶属植物淡竹叶Lophatherum gracileBrongn.的干燥茎叶，石膏为硫酸盐类矿物硬石膏族石膏Gypsum Fibrosum（主含CaSO4·2H2O），麦冬为百合科沿阶草属植物麦冬Ophiopogon japonicus(L.F) Ker-Gawl.的干燥块根，人参为五加科人参属植物人参Panax ginsengC.A.Mey.干燥根及根茎，半夏为天南星科半夏属植物半夏Pinellia ternate(Thunb.) Breit.的干燥块根，甘草为豆科甘草属植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.的干燥根及根茎，质量均符合《中国药典》2020年版一部要求，粳米为河南大米；批号信息见表1。

2 方法与结果

2.1 ZSD 物质基准的制备

采用随机数表法，分别对方中各药味饮片进行随机组合，见表2。根据课题组前期考证[16-19]，确定ZSD 剂量为淡竹叶6 g，石膏48 g，麦冬31 g，半夏12 g，人参6 g，甘草6 g。

称取ZSD 中各药味饮片于砂锅中，加入2000 mL 水，浸泡30 min，电陶炉武火（2200 W）转文火（600 W）煎煮至1200 mL，200 目绢布滤过，滤液加粳米24 g，煎煮70 min，滤去粳米，调整体积至600 mL。滤液于真空冷冻干燥机中预冷冻后，冷冻干燥，即得20 批ZSD 物质基准样品。同法制备各单味药和阴性样品。

2.2 ZSD 物质基准特征图谱的建立

2.2.1 色谱条件 Thermo C18色谱柱（250 mm×4.6mm，5 μm）；流动相为0.05%磷酸-乙腈，梯度洗脱：0～10 min，5%乙腈；10～15 min，5%～10%乙腈；15～25 min，10%～19%乙腈；25～60 min，19%～24%乙腈；60～65 min，24%～30%乙腈；65～70 min，30%～75%乙腈；体积流量1.0 mL/min；柱温30 ℃；检测波长280 nm；进样量20 μL。

表1 ZSD 各药味信息Table 1 Information of ZSD

表2 20 批物质基准饮片组合Table 2 Information of 20 batches of substance benchmark

2.2.2 对照品溶液的制备 取异荭草苷、荭草苷、牡荆素、甘草苷、甘草素、异甘草苷、甘草酸对照品适量，精密称定，加80%甲醇制成制成质量浓度分别0.312、0.202、0.204、0.322、0.205、0.211、0.385 mg/mL 的混合对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备 取ZSD 冻干粉1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇20 mL，密塞，称定质量，超声处理20 min，放冷，称定质量，用80%甲醇溶液补足减失的质量，摇匀，0.22 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2.4 精密度考察 取同一供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱方法重复进样6 次，记录色谱图，以16号峰（甘草苷）为参照峰，计算各共有峰与参照峰的相对保留时间均小于0.62%，相对峰面积RSD 值均小于4.82%，表明仪器的精密度良好。

2.2.5 重复性考察 取同一批ZSD 物质基准，按“2.2.3”项下方法平行制备6 份供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样检测，结果各共有峰与参照峰的相对保留时间的RSD 值均小于1.28%，相对峰面积的RSD 值均小于4.59%，表明该方法的重复性良好。

2.2.6 稳定性考察 取同一供试品溶液，分别于供试品溶液制备后0、4、8、12、24 h，按“2.2.1”项下色谱条件测定，记录色谱图，结果各共有峰与参照峰相对保留时间的RSD 值均小于1.03%，相对峰面积的RSD 值均小于4.70%，表明供试品溶液在室温下24 h 内稳定性良好。

2.2.7 特征图谱的建立及相似度评价 取20 批ZSD 供试品溶液、混合对照品溶液、各单味药样品和阴性样品，按“2.2.1”项下色谱条件测定，记录56 min 色谱图。使用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012 版）”软件对20 批物质基准进行图谱叠加得图1，并生成对照特征图谱，见图2。

图1 20 批ZSD 物质基准特征图谱Fig.1 HPLC characteristic spectrum of substance benchmark of ZSD

图2 ZSD 物质基准特征图谱Fig.2 Characteristic spectrum of substance benchmark of ZSD

将特征图谱进行特征峰归属，对应图谱见图3、4，全方共确定21 个特征峰，经比对，其中峰5、9、12（异荭草苷）、13（荭草苷）、14（牡荆素）、17共6 个共有峰属于君药淡竹叶；峰3、4、6、8、10、11 属于臣药麦冬；峰1、2、7 属于臣药半夏；峰15、16（甘草苷）、18、19（甘草素）、20（异甘草苷）、21（甘草酸）属于佐使药甘草。

图3 ZSD 物质基准与单味药对照图谱Fig.3 Control spectrum of substance benchmark of ZSD and single-flavor drugs

20 批ZSD 物质基准（S1～S20）特征图谱与对照特征图谱相似度分别为0.986、0.989、0.992、0.993、0.981、0.997、0.977、0.950、0.961、0.952、0.989、0.979、0.946、0.980、0.964、0.993、0.976、0.956、0.989、0.966，均大于0.90，结果表明，20批ZSD 物质基准整体相似性均较好，说明ZSD 物质基准的制备工艺稳定，所建立的ZSD 物质基准特征图谱可用于评价方中药味质量传递规律。

2.2.8 饮片-物质基准特征图谱的传递分析 将各物质基准与其对应批次的各单味饮片的特征图谱分别导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2012版），对相应特征峰进行标记峰匹配，计算相似度，结果淡竹叶和麦冬均大于0.990，麦冬和半夏均大于0.900，各单味药与物质基准中对应特征峰的相似度良好。结果表明，ZSD 物质基准与饮片指纹图谱间的整体相似度良好，饮片中物质群向物质基准中传递较为稳定。

2.2.9 主成分分析（principal component analysis，PCA）和偏最小二乘判别分析（partial least squares- discriminant analysis，PLS-DA） 为分析不同批次ZSD 物质基准间的质量差异，以20 批ZSD 物质基准的21 个共有峰面积为原始数据，利用SIMCA- P14.1 软件进行PCA，结果显示，20 批样品可分为4 类，其中S1、S3、S16、S17 为一类，S2、S15 为一类，S4～S6、S11～S14、S18 为一类，S7～S10、S19、S20 为一类，见图5。

图4 ZSD 物质基准与各单味药阴性样品对照图谱Fig.4 Comparison of substance benchmark of ZSD and negative samples of each single-flavor drugs

图5 ZSD 物质基准PCA 得分图Fig.5 PCA scoring of substance benchmark of ZSD

为进一步分析各组间差异，并找出各组间差异成分，建立PLS-DA 模型，得分矩阵见图6，以PLS-DA 模型的可变投影重要度指数（VIP）大于1.0 和t检验P值小于0.05 为标准，筛选出11 个对分组贡献较高的峰，按VIP 大小顺序，分别为峰17、6、7、20（异甘草苷）、12（异荭草苷）、16（甘草苷）、10、19（甘草素）、15、8、18，结果见图7。

图6 ZSD 物质基准的PLS-DA 的得分矩阵Fig.6 PLS-DA score matrix of 15 batches of substance benchmark of ZSD

图7 ZSD 物质基准PLS-DA 的VIP 值Fig.7 VIP values of substance benchmark of ZSD by PLS-DA

2.3 6 种指标成分含量测定

2.3.1 指标选择 木犀草素黄酮苷类成分为淡竹叶中主要药效成分，具有解热、抗炎、利尿、保护DNA免受氧化损伤的作用[20-21]。其中异荭草苷含量较高、分离度良好、转移率稳定、无阴性干扰；实验中发现半夏中主要成分在复方中存在阴性干扰，麦冬药 材、饮片中含量较高的皂苷类成分在方中煎煮后出现不同程度的转化，转移率偏差较大，不适合作为含量测定指标。因此，最终选择异荭草苷、甘草苷、甘草酸和人参皂苷Rg1、Re、Rb1为定量指标。

2.3.2 色谱条件

（1）异荭草苷：Thermo C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为0.05%磷酸水溶液-乙腈，梯度洗脱：0～10 min，5%～10%乙腈；10～20 min，10%乙腈；20～30 min，10%～13%乙腈；30～40 min，13%～15%乙腈；40～60 min，15%～16%乙腈；60～65 min，16%～5%乙腈；体积流量1.0 mL/min；柱温30 ℃；检测波长360 nm；进样量20 μL。

（2）甘草苷、甘草酸：Thermo C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为0.05%磷酸水溶液-乙腈，梯度洗脱：0～8 min，19%乙腈；8～35 min，19%～50%乙腈；35～36 min，50%～100%乙腈；36～40 min，100%乙腈；40～45 min，100%～19%乙腈；45～50 min，19%乙腈；检测波长237 nm；体积流量1.0 mL/min；柱温30 ℃；进样量10 μL。

（3）人参皂苷Rg1、Re、Rb1：Thermo C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为0.05%磷酸水溶液-乙腈，梯度洗脱：0～35 min，19%乙腈；35～55 min，19%～29%乙腈；55～70 min，29%乙腈；70～100 min，29%～40%乙腈；100～115 min，40%～19%乙腈；115～120 min，19%乙腈；检测波长为203 nm；体积流量为1.0 mL/min；柱温为35 ℃；进样量10 μL。

色谱图见图8～10。

图8 异荭草苷含量测定HPLC 图Fig.8 HPLC of isoorientin determination

图9 甘草苷和甘草酸含量测定HPLC 图Fig.9 HPLC of liquiritin and glycyrrhizic acid determination

图10 人参皂苷Rg1、Re、Rb1 含量测定HPLC 图Fig.10 HPLC of ginsenoside Rg1, Re and Rb1 determination

2.3.3 供试品溶液的制备

（1）异荭草苷：取ZSD 冻干粉1.0 g，精密称定，加30%甲醇20 mL，称定质量，超声处理20 min，放冷，称定质量，加30%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，经0.22 μm 微孔滤膜滤过，即得。

（2）甘草苷、甘草酸：取冻干粉0.5 g，精密称定，精密加入70%乙醇25 mL，称定质量，超声20 min，放冷，称定质量，加70%乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，经0.22 μm 微孔滤膜滤过，即得。

（3）人参皂苷Rg1、Re、Rb1：取冻干粉1.5 g，精密称定，加蒸馏水20 mL，超声处理20 min，加水饱和正丁醇20 mL 萃取2 次，合并上层，滤过，精密量取续滤液10 mL，至蒸发皿中蒸干，残渣加甲醇溶解至5 mL 量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，0.22 μm 微孔滤膜滤过，即得。

2.3.4 阴性样品的制备 按ZSD 制备工艺，制备缺淡竹叶、缺人参、缺甘草的阴性样品，并制备各阴性样品供试品溶液。

2.3.5 对照品溶液的制备 取异荭草苷、甘草苷、甘草酸和人参皂苷Rg1、Re、Rb1对照品适量，精密称定，加30%甲醇、70%乙醇、甲醇溶解，制得质量浓度分别为0.271、0.072、0.079、0.057、0.046、0.049 mg/mL 的各对照品溶液。

2.3.6 方法学考察 对含量测定方法进行方法学考察，结果见表3。结果显示本实验异荭草苷、甘草苷、甘草酸和人参皂苷Rg1、Re、Rb1含量测定专属性、线性、精密度、重复性、稳定性及准确度均良好。

2.4 指标成分的转移率测定

根据公式转移率＝(物质基准中各成分含量×物质基准质量)/(饮片中各成分含量×饮片投料量)，计算各成分转移率，结果见表4，结果显示，20 批物质基准异荭草苷转移率为31.94%～50.91%，甘草苷转移率为35.77%～62.55%，甘草酸转移率为13.09%～22.63%，人参皂苷Rg1转移率为57.28%～83.95%，人参皂苷Re 转移率为42.21%～72.27%，人参皂苷Rb1转移率为38.19%～64.57%，均符合相关规定（平均值的70%～130%）。

表3 含量测定方法学考察Table 3 Investigation on assay methodology

2.5 出膏率测定

按公式出膏率＝饮片投料量/物质基准质量计算出膏率，结果见表4。结果表明，20 批物质基准的出膏率为16.99%～27.06%，平均出膏率为21.77%，符合相关规定（平均值的70%～130%）。

3 讨论

3.1 物质基准的制备方法及药味来源

《伤寒论》中记载ZSD 制备方法为上七味，以水一斗，煮取六升，去滓，内粳米，煮米熟，汤成去米[1]。本研究根据ZSD 的处方剂量和煎煮方法，严格按原方描述进行煎煮，制备相应的物质基准对应实物，并参考了《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求（征求意见稿）》对物质基准进行冷冻干燥，冷冻干燥过程，保证质量的稳定，对处方中各药味的有效成分影响相对较少，保证化学成分的稳定性，亦方便储存。根据《申报资料（征求意见稿）》指导原则，收集各药味不少于3 个产地（包含道地药材产地、主产区）的20 批次药材进行研究，并炮制为对应饮片，结合复方物质基准质量研究，探索药材-饮片-物质基准的一致性传递规律。

表4 ZSD 物质基准中指标成分的含量、转移率和出膏率Table 4 Content, transfer rate and extraction amount of index components in substance standard of ZSD

续表4

3.2 特征图谱样品制备方法的考察

本实验对物质基准复溶溶剂、提取方式、提取时间和料液比进行了大量试验考察，结果显示，以80%甲醇为溶剂时，特征图谱各色谱峰分离效果较好；提取时间在20 min 以上时、提取率随时间延长无明显变化；料液比为1∶20 时提取率较高；不同提取方式对物质基准特征图谱无显著影响。因此最终确定样品制备方法为取ZSD 物质基准冻干粉1.0 g，加入80%甲醇20 mL，超声提取20 min，放冷，称定质量，用80%甲醇溶液补足减失的质量，滤过。

3.3 ZSD 物质基准特征峰归属

20 批ZSD 物质基准共确定了21 特征峰，分别归属于淡竹叶、半夏、麦冬和甘草。本实验尚存在不足之处，方中石膏、粳米、人参3 味药未指认出特征峰。石膏中主要成分为Ca2+和微量元素[22]，粳米中主要成分为淀粉，人参中主要成分最佳吸收波长为203 nm，但在203 nm 下检测时，仍未能检测出特征峰。对于色谱无法分离和因灵敏度不足而未检出的成分，课题组将采用其他方法进一步研究。

3.4 指标成分含量测定分析

经典名方物质基准是经典名方复方制剂的化学基准和生物效应基准。本研究在充分考虑药材来源、饮片炮制、制备工艺等影响质量的因素，系统开展药材、饮片及名方物质基准所对应实物质量研究，综合考虑并确定关键质量属性，据此建立相应的质量评价指标和评价方法，确定科学合理的物质基准质量标准。选择含量测定指标均建立在课题组大量实验的基础上。如ZSD 中君药石膏，《中国药典》2020年版中以含水硫酸钙为指标，无法采用色谱技术，研究组后期采用光谱方法对其进行质量控制。ZSD 全方共133 g，其中淡竹叶、甘草、人参各6 g，在方中仅占4.5%，因此指标成分含量普遍较低。该研究测定的20 批ZSD 物质基准中异荭草苷为0.041～0.188 mg/g，甘草苷为0.959～1.655 mg/g，甘草酸为1.074～1.900 mg/g，人参皂苷Rg1为0.399～0.622 mg/g，人参皂苷Re 为0.223～0.377 mg/g，人参皂苷Rb1为0.167～0.394 mg/g。

4 结论

物质基准作为经典名方制剂的质量基准和衡量其质量的标准参照物，在经典名方开发中至关重要。本研究根据文献研究的结果及相关指导原则确定了ZSD 的处方组成、煎煮方法，按照现代研究方法，制备了ZSD 物质基准对应实物，20 批ZSD 物质基准特征图谱相似度较高，6 个指标成分转移率、出膏率在均值±30%之间，表明该制备工艺稳定。在含量测定和特征图谱中体现出了处方各药味的信息，并初步确定了指标成分转移率、对应实物出膏率的要求限度，为经典名方ZSD 复方制剂的研究奠定基础。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突