不同播种密度及种子挥发物柠檬烯对三七种子萌发的影响*

马文敬，刘 爽，刘屹湘，杨 敏，何霞红,2，朱有勇，朱书生，黄惠川

(1.云南农业大学 植物保护学院，云南生物资源保护与利用国家重点实验室，云南 昆明 650201；2.西南林业大学，云南 昆明 650224)

三七[Panax notoginseng(Bruk) F.H.Chen]为五加科人参属植物，是中国重要的中药材大品种之一。合理密植对促进三七生长和提高三七品质具有重要意义，不同种植密度对三七的出苗和生长具有显著影响，但不同密度对三七种子萌发和品质形成的影响，尤其是三七种子挥发物在此过程中的化感功能尚无研究报道。因此，本研究旨在探明合理的三七播种密度以及在此过程中种子挥发物中关键化合物的功能，为进一步指导生产合理密植和合理直播种植、实现三七高质量生态化生产提供科学依据。

种植密度对植物的生长发育有着重要的影响，合理的种植密度不仅能促进植株的生长发育，还能节约种植成本、提高土地利用率，进而增加单位面积的经济效益[1]。张春梅等[2]研究发现：合理的播种密度能够提高百里香种子的萌发率且能显著提高种子的发芽势；安霞等[3]研究发现：相比3 万株/666.7 m2和8 万株/666.7 m2的种植密度，5 万株/666.7 m2的种植密度能够显著提高苎麻的出苗率，并能有效增加植株茎粗和地上部分的鲜质量；李丽淑等[4]也发现：适宜的种植密度能够显著提高姜三七的产量；BRAZ 等[5]发现：合理的种植密度能够显著促进向日葵的干物质积累并提高植株的叶面积指数，进而促进植株后期的生长发育。种植密度的改变一方面会引起植物种内资源竞争进而影响植株的生长发育，另一方面也能影响植物化学通讯进而调控植株的生长和代谢。

植物挥发物被认为是潜在影响种子萌发和生长的关键因子之一；其中，萜烯类作为植物体内最大的一类次生代谢物，对植物的生长发育具有重要的调控作用。FISCHER 等[6]认为：植物挥发物中的萜烯类化合物对植物种子的萌发和生长具有显著的影响；LEE 等[7]发现：β-蒎烯和3-蒈烯等萜烯类化合物对番茄种子的萌发具有显著的促进作用；ARECO 等[8]研究发现：一定浓度的α-蒎烯能够显著促进玉米种子根系的伸长。除蒎烯外，柠檬烯是天然植物中分布最广也是最重要的萜烯类化合物。潘丹[9]研究发现：柠檬烯能够显著促进黄岑种子的萌发。但除此之外，绝大部分有关柠檬烯的研究均围绕其抑菌活性展开，如柠檬烯对指状青霉孢子萌发的作用及对黑曲霉、啤酒酵母和枯草芽孢杆菌生长的抑制等[10-12]。然而，柠檬烯对植物生长发育的诱导调控等功能还有待进一步研究。

朱有勇团队在生产实践中发现：三七高密度播种能够提高种子的发芽势及发芽率(未发表)，然而这一现象背后的科学原理尚无文献报道。明确最适宜三七种子萌发的播种密度，利用气相色谱—质谱联用技术分析鉴定在此过程中的关键化合物，并验证该化合物对三七种子萌发的影响，初步探明三七种子挥发物中关键化合物对三七种子萌发的影响，可为揭示不同播种密度影响三七种子萌发的化感机制提供数据支撑，同时为指导生产设计合理的播种密度提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

三七种子购于云南文山三七国际交易市场；生菜种子购于高华种子有限公司；葡萄糖、吸附树脂、尼龙滤膜(0.22 μm)等主要试剂购自上海源叶科技有限公司，柠檬烯(213867) 和丙酮(270725)购自Sigma-Aldrich 公司，正己烷(110-54-3)购自Fisher Chemical 公司。主要设备仪器：气相色谱—质谱联用仪(Shimadzu GCMSQP2010 SE)、移液器(Eppendorf，德国) 和挥发物收集装置(自制)。

1.2 试验方法

1.2.1 不同种植密度小区试验设置

田间试验设置于云南农业大学大河桥教育教学实践基地(下称大河桥基地)大棚中，试验共设置400、144、100、36 和25 株/m25 个播种密度，每个密度设置4 个重复，每个重复20 m2。

1.2.2 农艺性状的测定

分别调查不同播种密度下三七的出苗率和存苗率，每个重复随机选取6 m2进行调查。采用五点取样法分别调查不同播种密度下三七的株高、地上部和地下部鲜质量和干质量以及单位面积产量，每个重复调查20 株。

1.2.3 三七种子挥发物的收集

利用自制收集装置(图1)收集三七种子的气态挥发物。取1.5 kg 三七种子，洗净后置于干燥玻璃缸中，打开空气泵进行抽气，外界空气经活性炭吸附杂质后进入变色硅胶吸收水分，然后进入干燥缸内，空气经干燥缸后与挥发物一起进入吸附柱进行吸附，剩余空气进入空气泵并排回到环境中。种子挥发物采用此装置连续收集90 h，并设置3 个重复。

图1 挥发物收集装置示意Fig.1 Schematic of volatiles collection device

1.2.4 三七种子挥发物的分离鉴定

收集完毕后取下吸附柱，用正己烷洗脱出5 mL，然后用氮气吹仪浓缩至3 mL，最后用0.22 μm 滤膜过滤并装入棕色的样品瓶中，利用GC-MS 上机检测。GC 条件：SH-Rxi-5Sil MS 色谱柱(30.0 m×0.25 mm×0.25 μm)，起始柱温40 ℃，以3.0 ℃/min 升温至80.0 ℃后，以5.0 ℃/min 升温至260.0 ℃，保持30.00 min。载气为氦气，进样口温度250.0 ℃，进样量2.0 μL，进样方式为分流进样，分流比10∶1。MS 条件：EI 电离源，离子源温度230.0 ℃，接口温度250.0 ℃，扫描范围35～500 m/z，采集方式Scan，扫描间隔0.30 s。挥发物成分鉴定通过NIST14s 谱图库检索保留时间，选取相似度80%以上的化合物，通过峰面积的百分比确定化合物的相对含量。

1.2.5 柠檬烯对种子萌发的测定

在组培瓶中加入100 g 灭菌土，每瓶均匀点播9 粒三七种子，加入适量灭菌dd H2O。将灭菌后的1.5 mL 离心管盖置于组培瓶中央。柠檬烯处理设置2、20 和200 μL/L 3 个体积分数并设置空白对照，每个处理设置4 个重复，90 d 后记录三七出苗情况。在培养皿中放置1 张灭菌滤纸并用灭菌水润湿，在滤纸上放置20 粒生菜种子，将灭菌后的1.5 mL 离心管盖置于培养皿中央，分别向其中添加0.5、1、5 和10 μL/L 4 个体积分数的柠檬烯标准品，以等量的灭菌dd H2O 为对照，每个处理设置4 个重复，7 d 后记录生菜种子的萌发情况。

1.2.6 试验数据处理方法

试验数据采用IBM SPSS 19 以及Microsoft Excel 2016 软件进行统计分析，采用Duncan 氏新复极差法进行差异显著性分析，每个测定进行4 个重复，结果以“平均值±标准误差”表示。利用Microsoft Excel 2016 软件进行图表制作。

2 结果与分析

2.1 不同密度处理对三七出苗及存苗的影响

由图2 可知：种植密度为100 株/m2的三七出苗率最高，为93.73%；种植密度为400 株/m2的三七出苗率最低仅为79.08%。种植密度144、100、36 和25 株/m2之间的三七种子出苗率没有显著性差异，但均显著高于400 株/m2密度处理。

图2 不同密度处理三七出苗率和存苗率比较Fig.2 The germination rates and survival rates of P.notoginseng under different sowing densities

由图2 可知：种植密度为144 株/m2的三七存苗率为90.00%，显著高于其他4 个密度处理的三七种子(P＜0.05)，而种植密度为25、36、100 和400 株/m2的三七存苗率分别为77.33%、74.33%、75.33%和77.33%。

2.2 不同密度处理对三七农艺性状的影响

由表1 可知：种植密度为400 株/m2的三七株高为(11.72±0.20) cm，显著高于除种植密度为144 株/m2以外的其他密度下种植的三七。种植密度为144、100、36 和25 株/m2的三七株高分别为(11.03±0.25)、(10.24±0.30)、(10.44±0.18)和(10.33±0.30) cm。株高整体上随着种植密度的增加而增加，而地上部鲜质量、地上部干质量、地下部鲜质量和地上部干质量均无显著差异。种植密度为144 株/m2和100 株/m2的三七地下部鲜质量和干质量均高于其他种植密度处理。

表1 不同密度处理对三七农艺性状的影响Tab.1 Effects of different densities on the agronomic traits of P.notoginseng

2.3 不同密度处理对三七产量的影响

由表2 可知：种植密度为400 株/m2的三七单位面积产量最高，为129.71 g/m2；25 株/m2的三七单位面积产量最低，为7.98 g/m2。从单位面积产量看，三七产量随着密度的增加而增加，但通过比较可见：100 和144 株/m2种植密度的单株产量(地下部干质量)高于400、36 和25 株/m2种植密度的单株产量(地下部干质量)。

2.4 三七种子挥发物GC-MS 分析结果

利用GC-MS 从三七种子挥发物中共检测到烯烃类、烷烃类、酮类、苯类、醇类、酸类、酯类、醛类、酚类、萘类、酰胺类及硫化物共计12 类物质，共计53 种(筛选相似度在80%以上)。其中，烯烃类物质16 种，相对含量为39.44%；烷烃类物质18 种，相对含量为22.44%；酮类物质3 种，相对含量为10.25%；苯类物质5 种，相对含量11.27%；醇类物质1 种，相对含量为0.56%；酸类物质1 种，相对含量为0.62%；酯类物质3 种，相对含量为3.48%；醛类物质1 种，相对含量为0.86%；酚类物质1 种，相对含量为8.61%；萘类物质2 种，相对含量为1.42%；酰胺类物质1 种，相对含量为0.68%；硫化物1 种，相对含量为0.35% (表3)。

三七种子挥发物组成成分复杂，不同种类的化合物相对含量差异明显，主要以烯烃和烷烃类化合物为主，其中，烯烃类化合物的相对含量最高。通过收集三七种子挥发物共检测到16 种烯烃类化合物，相对含量最高的3 种分别为柠檬烯、β-可巴烯和D 大牛儿烯，其中柠檬烯的相对含量最高，为7.74% (表3)。

2.5 三七种子挥发物柠檬烯对种子萌发的影响

由表4 可以看出：空白对照处理下，三七种子出苗率为16.5%，20 μL/L 柠檬烯处理条件下的三七种子出苗率为13.8%，200 μL/L 柠檬烯处理下的三七种子出苗率为15.4%。2 μL/L 柠檬烯处理下的三七种子出苗率为28.6%，显著高于20、200 μL/L 的处理和空白对照，说明2 μL/L柠檬烯能显著促进三七出苗。

此外，由表5 可以看出：1 μL/L 柠檬烯处理后的生菜种子萌发率为88.33%，显著高于CK，而其余3 个处理对生菜种子的萌发均有一定程度的抑制。

3 讨论

播种密度与作物的生长发育有着密切的联系，合理的种植密度能够提高作物的产量和品质。李漫[13]研究发现：在一定范围内提高种植密度，能够显著增加春玉米的株高、茎粗和产量；周永萍等[14]研究发现：提高种植密度可以显著增加棉花的茎粗、单株结铃数和单位面积的总成铃数；武晓攀等[15]研究发现：随着种植密度的增加，玉米品种北青340 的穗长和千株质量先略微增加后下降，穗粗和穗株数减少。本研究发现：播种密度对三七种子的存苗率、株高等农艺性状均有不同程度的影响。播种密度144 株/m2时三七种子的出苗率和存苗率均高于其他播种密度，且均显著高于生产上广泛使用的400 株/m2的播种密度。高密度播种条件下，一方面三七种子可能受高浓度气态挥发物的影响，抑制了种子的萌发从而降低了出苗率；另一方面，过高的播种密度导致植株生长后期的竞争效应加剧，长势较弱的植株逐渐在资源竞争中被淘汰，进而导致存苗率下降。然而，虽然400 株/m2播种密度处理下三七的出苗率和存苗率都显著低于144 株/m2处理，但由表2 可以看出：高密度播种处理下单位面积内三七的总株数和总产量仍处于较高水平，因此，目前生产上仍采用高密度播种的方式进行三七生产，这也与崔秀明等[16]的研究结果一致。

表2 不同密度条件处理下三七产量Tab.2 Effects of different densities on yield of P.notoginseng

挥发性有机化合物介导的植物—昆虫、植物—微生物及植物—植物互作是当前国际研究的热点。国内外已有大量研究表明：许多植物能够利用萜烯类、苯类、苯丙烷类和脂肪酸衍生物等挥发性有机化合物与周围环境中的昆虫、微生物和植物进行信号交流以保证植物的生长、发育、防御和生命周期等[17]。植物受食草动物侵袭后，能够通过释放绿叶挥发物(green leaf volatiles，GLVs)和诱导性挥发物(herbivore-induced plant volatiles，HIPVs)来诱导和增强植株的防御表达[18-19]，并吸引食草动物的天敌以抵御侵袭[20-21]。还有研究表明：植株能对土壤中的芽孢杆菌、假单胞菌和根瘤菌等释放的挥发物，如3-羟基-2-丁酮、3-戊醇和乙酰丙酮等做出响应，改变自身的生长、代谢和防御[22]。此外，挥发性有机化合物在植物—植物互作中也发挥着重要的作用。研究发现：拟南芥释放出的GLV 能够调控体内WRKYs 转录因子的表达和γ-氨基丁酸(GABA)的生物合成，从而调控根系生长[23-24]。α-蒎烯和β-蒎烯等萜烯类化合物能增加拟南芥叶片中ROS 的积累进而增强植株的抗性[25-26]。

表3 三七种子挥发物的化学成分及相对含量Tab.3 Chemical components and relative contents of P.notoginseng seed volatiles

表4 不同体积分数柠檬烯对三七种子萌发的影响Tab.4 Effect of different concentrations of limonene on seeds germination of P.notoginseng

本研究在三七种子挥发物中共发现12 类化合物，萜烯类是主要化合物类型，相对含量为39.44%；其中，萜烯类化合物柠檬烯的含量最高，达7.74%。研究结果表明：适宜体积分数的柠檬烯能够促进三七种子的萌发，而过低和过高体积分数的柠檬烯则会抑制三七种子的萌发，在生菜种子上重复这一试验也得到了相似的结果，而且生菜种子对于柠檬烯的浓度表现出更高的敏感性(表5)，这一现象与FISCHER 等[6]报道的胡桃醌、龙脑等萜类化合物对Rudbeckia hirta种子萌发“低促高抑”的现象一致。这是否是较高播种密度下三七种子萌发率较高的原因还有待进一步验证。

表5 不同体积分数柠檬烯对生菜种子萌发的影响Tab.5 Effect of different concentrations of limonene on seeds germination of Lactuca sativa L.var.ramosa Hort.

然而，由于三七种子在实际种植环境中面临的环境因子较为复杂，三七种子释放柠檬烯是否受其他信号物质的诱导调控、不同播种密度下三七种子释放柠檬烯的量是否存在差异等仍不清楚，因此，进一步深入探明不同播种密度下柠檬烯刺激种子萌发的机制，一方面有望在生产上利用柠檬烯作为种子萌发的处理制剂，另一方面将有助于三七种植生产高质量高效率地发展。

4 结论

播种密度对三七的出苗率和存苗率均有显著的影响。144 株/m2的播种密度能够显著提高三七的存苗率，采用这一播种密度对三七高质量高效率生产具有重要的实践意义。通过GC-MS 分析鉴定出的三七种子挥发物中的萜烯类化合物柠檬烯在适宜体积分数范围内能够显著促进三七和生菜种子的萌发，柠檬烯作为促进作物种子萌发的制剂具有一定的应用前景。