大白菜核不育花药绒毡层的异常细胞程序性死亡(PCD)导致小孢子败育研究*

郭瑛琪，李 祥，崔海芳，侯凌云，岳艳玲**

(1.中国科学院 昆明动物研究所，云南 昆明 650223；2.山西高地草莓育苗有限公司，山西 长治 046000；3.漯河食品职业学院，河南 漯河 462300；4.云南农业大学 园林园艺学院，云南 昆明 650201)

复等位核雄性不育具有雄蕊退化彻底、不育性稳定等特点，且不受细胞质影响，没有正、反交遗传效应，是比较理想的大白菜雄性不育材料[1]。经过多代转育，云南农业大学园林园艺学院大白菜育种实验室已成功将该核不育基因向不同类型的大白菜中转育，获得多个具有100%不育株率的核基因雄性不育系[2-5]。本试验从细胞程序性死亡(programmed cell death，PCD)角度研究花药败育的原因，进一步探索雄性不育发生的机理。绒毡层是花药药壁组织的最内层，由雄蕊原基的L2 和L3 层共同发育而来[6]。在小孢子母细胞减数分裂早期，绒毡层完成自身的核内有丝分裂，形成多核的细胞，进而转变为一种极性的分泌细胞，输送小孢子发生和发育过程所需的营养物质[7]。减数分裂结束后，绒毡层细胞合成胼胝质酶，分解包围四分体的胼胝质壁，释放单核小孢子[8]。当小孢子从四分体中释放出来后，绒毡层细胞开始降解，并向药室释放营养物质，如脂质、蛋白质和糖类等，调控着花粉壁的形成以及花粉与柱头的识别[9]。同时绒毡层的解体产物还是花粉合成DNA、RNA、蛋白质和淀粉的原料[10]。因此，绒毡层的发育及其降解对小孢子的发生和发育起着至关重要的作用，绒毡层细胞形态和降解的时间均会影响小孢子的生长，进而引起雄性不育。

大白菜(Brassica campestrisL.ssp.pekinensis)起源于中国，是中国主要的蔬菜[11]，利用雄性不育系生产一代杂种，可以克服双亲生活力衰退、杂交种子纯度不是100%等问题[12]。绒毡层异常与小孢子败育有关已得到广泛认可[13-16]，利用细胞学方法进一步研究绒毡层与小孢子之间的关系，可进一步探究雄性不育的发生机理。为进一步深入探索大白菜核基因雄性不育系的败育机制，本研究以核不育近等基因系10L03 为试材，利用石蜡切片显微观察和TUNEL [terminal dexynucleotidyl transferase (TdT)-mediated dUTP nick end labeling] 检测技术观察小孢子败育过程中绒毡层细胞的发育和降解动态，以期为揭示大白菜核不育小孢子的败育机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

大白菜核不育近等基因系10L03，系内兄妹交后代育性保持1∶1 分离，可育株自交后代可育株与不育株3∶1 分离，由云南农业大学园林园艺学院大白菜育种实验室选育而成。试材种植于云南农业大学蔬菜基地大棚内，于盛花期取不同育性不同发育时期的花蕾固定于FAA 固定液中，4 ℃冰箱保存备用。

1.2 方法

采用李正理[17]的方法制作石蜡切片，切片厚度8 μm，苏木素染色。选择结构清晰的石蜡切片进行TUNEL 检测，方法按Roche 公司In SituCell Death Detection Kit，TRM red 试剂盒说明书进行，徕卡DM 2000 光学显微镜观察并拍照。

2 结果与分析

2.1 小孢子败育过程中花药绒毡层细胞结构异常

大白菜核不育近等基因系可育花药在花粉母细胞时期花药壁各层细胞分化完全，可见完整的绒毡层，此时花粉母细胞较大，细胞间排列紧密(图1a)。花粉母细胞继续发育，于药室中分散，染色较深，细胞核极大，能看到有些花粉母细胞内形成两团染色质，发生减数分裂，此时的绒毡层细胞与花粉母细胞大小相近，细胞中可以看到液泡，排列紧密(图1b)。随后进入四分体时期，药室中形成四分体，由胼胝质包裹和分隔，这一时期的小孢子总体呈圆形，绒毡层细胞排列规则紧密，细胞内含物丰富，细胞间分隔不明显，无法看清细胞核和液泡等细胞内部结构(图1c)。随着小孢子的进一步发育，可育花药中包裹四分体的胼胝质被降解，释放出单核小孢子，显微镜下呈三叶草形，结构清晰，绒毡层细胞无法分辨个数，并且出现未染色的空白斑点，发生降解(图1d)。小孢子不断发育，形成染色深的圆形颗粒，可以清晰地看到大液泡和单个细胞核，此时绒毡层虽然存在，但其细胞内空白部分增多，整体染色变浅，而且薄厚不均匀，可见绒毡层细胞已出现一定程度的降解(图1e)。当绒毡层完全消失，花粉发育成熟，可见花药同侧两药室中间的薄壁细胞断开，准备散粉(图1f)。

不育花药绒毡层在花粉母细胞时期同可育花药一样，排列紧凑，可见发育正常的花粉母细胞(图1g)。之后时期花粉母细胞与可育材料一样，染色较深，细胞核大，有细胞正在减数分裂，绒毡层细胞与可育材料近似，排列紧密，但液泡更多更大，而且绒毡层细胞比花粉母细胞大(图1h)。不育小孢子能够进行第2 次分裂形成四分体，但四分体形状不规则，可以看到不规则的正四面体，都聚集在一起；此时绒毡层细胞膨大变长，内部出现空泡化，向内挤压小孢子(图1i)。绒毡层继续向内膨大，小孢子被挤压成团无法看清形态(图1j)。随着花药的进一步发育，绒毡层细胞进一步膨大，几乎占满整个药腔，药室内细胞相互粘连，不同药腔败育程度不同，有些药腔开始皱缩变形(图1k)。最后不育株的药腔完全干瘪坍塌，剩下一些细胞残体染色较深(图1l)。

图1 核不育近等基因系10L03 花药发育过程Fig.1 Light-microscopic observation of the anther development of GMS line 10L03

2.2 小孢子败育过程中花药绒毡层提前爆发PCD

大白菜核不育近等基因系不育和可育株花药，在母细胞时期，TUNEL 标记结果均未发现明显阳性信号(图2a、g)，说明DNA 没有发生断裂，这一时期可育和不育花药各层细胞都没有发生PCD。花粉母细胞进一步发育进入减数分裂时期，TUNEL 检测可育花药和不育花药出现差异。在减数分裂时期，可育花药横切图中的绒毡层细胞较大，结构完整，边界清晰，小孢子饱满(图2b)；而不育花药纵切图中的绒毡层细胞界限不够清晰，绒毡层细胞出现明显的阳性信号(图2h)。随后进入四分体时期，TUNEL 检测显示小孢子进入四分体时期后，可育和不育的细胞差异更加明显。可育花药绒毡层部分细胞出现了阳性信号，说明此时可育花药绒毡层细胞正在发生PCD，而且PCD 的发生并不是同时开始，而是逐个凋亡(图2c)。在不育的花药中，绒毡层体积异常膨大并且空泡化明显，小孢子聚集在药腔中央，严重变形，同时出现明显的阳性信号，说明小孢子细胞核DNA 也出现断裂，发生了凋亡(图2i)。随着小孢子的进一步发育，TUNEL 检测可育小孢子从四分体释放后进入单核期，绒毡层细胞有的可见絮状荧光，而有的无荧光，进一步说明可育花药绒毡层细胞PCD 不是同时发生(图2d)。在单核晚期，可育花药单核孢子外聚积孢粉素开始形成花粉外壁，大部分绒毡层出现荧光，达到绒毡层凋亡降解的高峰期(图2e)。而不育花药从单核期开始就已无法区分具体时期，可见绒毡层细胞膨大，绒毡层处于解体状态，小孢子有阳性信号，说明此时期小孢子也发生了PCD 正在凋亡(图2j，与图1j 出自同一材料同一位置)。进一步败育不育株药腔开始向内塌陷干瘪，高度膨大的绒毡层和药腔内荧光信号明显，小孢子皱缩变形，聚在一起(图2k)。可育花药的药腔内有成熟花粉粒，绒毡层全部解体，无阳性信号出现，花粉外壁有孢粉素的沉积，所以出现自发荧光(图2f)；不育花药的药腔完全干瘪，绒毡层和中层细胞以及小孢子等全部降解，散乱聚集，无法区分结构，药腔内有明显的阳性信号，为残留的细胞断裂破碎的DNA (图2l)。

3 讨论

被子植物花粉的发育依次经过造孢细胞时期、花粉母细胞时期、减数分裂时期、四分体时期、单核小孢子时期以及成熟花粉粒时期，最终发育成具有育性的花粉。但在许多植物中也发现雄蕊不能够正常地形成花粉或形成的花粉不能够产生种子的现象，即雄性不育。在植物中雄性不育发生的时期和方式是多种多样的，可以发生在花药发育的各个时期，主要集中在花粉母细胞时期、减数分裂时期、四分体时期和单核期。就双子叶植物而言，花药败育则多发生在四分体时期或小孢子发育早期阶段[18]。王福青等[19]以大白菜核雄性不育系为材料，发现花药发育受阻于花粉母细胞时期，减数分裂出现异常；谢潮添等[20]以白菜细胞核雄性不育系为材料，四分体的4 个小孢子分离时出现异常，不育花药绒毡层细胞膨大并且液泡化明显，导致败育；许明等[21]以大白菜细胞核雄性不育甲型“两用系”为材料，通过细胞学观察，发现败育时期为减数分裂后期到四分体时期。本试验的研究结果表明：大白菜核不育花药败育起始于减数分裂期，绒毡层提前发生PCD，而小孢子的败育起始于四分体时期。

绒毡层包围着花粉母细胞和小孢子并与其相互作用。当小孢子从四分体中释放出来后，绒毡层细胞开始降解，并向药室释放营养物质，调控着花粉壁的形成以及花粉与柱头的识别。绒毡层的发育及其降解异常会严重影响小孢子的发生和发育，导致雄性不育。谢潮添等[22]在光敏不育水稻不育花药中发现：绒毡层没有随着小孢子的发育而退化，却一直保留到花药成熟的开花期，导致水稻小孢子败育；FALASCA 等[23]以猕猴桃为材料，发现雄性不育材料绒毡层退化比可育材料晚；童哲等[24]利用电镜观察对水稻农垦58S 花药进行观察发现：在减数分裂时期以前绒毡层内细胞器出现变换，减数分裂时期绒毡层内侧细胞壁提前降解，分泌孢粉素，导致了败育。本研究发现：大白菜核不育花药绒毡层细胞结构从减数分裂开始出现异常，但小孢子可以发育到四分体时期，此时绒毡层细胞异常膨大，未能成功释放单核小孢子，最终小孢子干瘪死亡；可育花药绒毡层细胞是逐个降解，直至散粉前才全部消失，这种绒毡层的提前降解导致小孢子发育所需的物质无法提供，引起小孢子败育。

早在1997 年，PACINI[25]通过电镜观察证实Lobivia rauschii和Tillandsia albida花药绒毡层的降解具有明显的PCD 特征。之后，在禾本科、茄科和百合科等多种植物中证实花药绒毡层是植物生长发育过程中的一种PCD 事件，最终表现为细胞凋亡，可观察到细胞核核膜发生内陷、染色质浓缩和DNA 断裂，可用TUNEL 法进行检测[26-30]。花药绒毡层细胞在特定发育时期的PCD与花粉的发育密切相关，当四分体分开后，绒毡层细胞开始降解，为单核小孢子的进一步发育提供养分，绒毡层降解也是小孢子发育的启动，所以认为绒毡层是以PCD 的形式适时为小孢子发育提供营养和结构物质。同时绒毡层的降解也为花粉长大提供空间。张虹等[31]对水稻花药绒毡层细胞发育的TUNEL 检测结果表明：在水稻花药发育过程中，绒毡层细胞PCD 的TUNEL 阳性信号出现在四分体时期，有些花药绒毡层细胞PCD 的发生还会受到温度的影响。绒毡层细胞PCD 有关的基因发生突变时，会使绒毡层细胞出现异常降解，或提前[32]或延迟[33]。本研究经过TUNEL 标记发现：可育花药TUNEL 检测绒毡层细胞的阳性信号出现在四分体时期，并且是部分细胞有信号，且一直持续到花粉成熟，说明绒毡层细胞降解向小孢子释放养分是一个连续的过程。而不育花药绒毡层细胞在减数分裂时期就已出现阳性信号，说明绒毡层细胞提前发生PCD，小孢子也随之出现阳性信号，发生凋亡。绒毡层细胞提前降解，不能持续供应小孢子发育所需的物质，可能是导致小孢子最终死亡的直接原因。

STEIGLITZ[34]研究表明：在小孢子母细胞完成减数分裂后，绒毡层适时地分泌胼胝质酶以分解包裹四分孢子的胼胝质壁，释放小孢子。从本研究可知：大白菜可育花药绒毡层四分体时期就出现了阳性信号，说明此时存在DNA 的断裂现象，而此时四分体小孢子依旧被胼胝质包裹着，可绒毡层已经开始凋亡，所以经分析认为胼胝质酶的运转并不是单纯的分泌，而可能由绒毡层的降解释放到药腔，降解包围四分体的胼胝质，释放单核小孢子。李振兴[35]的研究结果亦可见不育小孢子能够发育形成四分体，但不能及时释放单核小孢子这一现象；经苯胺兰染色观察发现：包裹四分小孢子的胼胝质不能被降解，而持续存在直至小孢子凋亡，说明不能正常释放单核小孢子的原因是包裹四分小孢子的胼胝未能被降解，从而导致小孢子发育受阻引起完全败育。另外，本研究还发现：可育花药绒毡层细胞PCD 现象是不规律的逐个出现，而非同时发生，说明绒毡层的凋亡具有先后顺序，并非同时全部凋亡，但在不育株中PCD 的出现是同时间大量发生的，说明在小孢子发育过程中，整个绒毡层的PCD 过程受到严格调控，大量绒毡层细胞爆发性PCD说明不育花药绒毡层的调控机制可能发生了紊乱，导致绒毡层细胞的降解不受控制，使得小孢子进一步发育所需的物质得不到持续的供应进而引发完全败育。

4 结论

大白菜核不育花药败育起始于减数分裂期绒毡层异常，小孢子在四分体时期开始败育；不育发生后，伴随着绒毡层细胞异常膨大，严重空泡化，提前降解，小孢子变形干瘪而死亡。大白菜核不育败育花药绒毡层细胞提前在花粉母细胞减数分裂期发生PCD，绒毡层细胞提前集体降解，不能连续不断地向发育中的小孢子供应发育所需的物质，是小孢子发育不良从而败育的重要原因。绒毡层细胞提前PCD 还导致胼胝质酶异常，不能正常释放单核小孢子，使小孢子的进一步发育受阻而引起完全败育，是导致小孢子败育的直接原因。