不同产地罗布麻叶UPLC特征图谱及黄酮类成分含量测定△

吴淑珍，何民友，李国卫，吴文平，邱韵静，曾荟，潘礼业

广东一方制药有限公司 广东省中药配方颗粒企业重点实验室，广东 佛山 528244

罗布麻叶为夹竹桃科植物罗布麻ApocynumvenetumL.的干燥叶，为夏季采收，除去杂质，干燥。其具有平肝安神、清热利水的功效，可用于治疗肝阳眩晕、心悸失眠、浮肿尿少[1]。罗布麻叶中主要含黄酮类、酸类、脂肪酸醇酯类、醇类、鞣质类、甾体类、糖类、氨基酸类、挥发油、矿物质元素等化学成分[2-13]。其中，黄酮类为罗布麻叶的主要活性成分，具有抗抑郁、抗氧化、降血压、调血脂、保肝等功效，具有较高的开发利用价值[14-15]。罗布麻是一种抗逆性极强的宿根性多年生直立半灌木，多野生在盐碱荒地、滩涂湿地及河流湖泊沿岸、戈壁荒滩等盐碱度较高的土壤中，在我国主要分布于河南、安徽、湖南、四川、甘肃、江苏、陕西、山西、河北等地[16]。张月婵等[17]采用高效液相色谱法(HPLC)建立特征图谱，并分析了不同产地罗布麻叶中槲皮素的含量。结果表明，不同来源罗布麻叶HPLC特征图谱及槲皮素的含量均具有一定差异。宋建平等[18]和王媚等[19]分别采用HPLC、高效毛细管电泳法(HPCE)建立了罗布麻叶的特征图谱分析方法，同时评价了不同产地罗布麻叶药材的质量。

目前，虽有文献研究罗布麻叶药材特征图谱或指纹图谱，但仅以相似度为评价指标，未对其色谱峰进行统计学分析。《中华人民共和国药典》(以下简称《中国药典》)2020年版罗布麻叶项下以金丝桃苷作为指标成分，难以全面反映其质量。本实验采用超高效液相色谱法(UPLC)建立罗布麻叶药材特征图谱，结合相似度、主成分分析及聚类判别模式对不同产地的罗布麻叶药材进行质量分析，并对2个黄酮类成分进行含量测定，为罗布麻叶药材质量控制提供参考。

1 材料

1.1 仪器

H-Class型超高效液相色谱仪(美国沃特世有限公司)；Vanquish型超高效液相色谱仪[赛默飞世尔科技(中国)有限公司]；Waters CORTECS T3型色谱柱(100 mm×2.1 mm，1.6 μm)；ME204E型万分之一天平、XP26型百万分之一天平(梅特勒-托利多公司)。

1.2 试药

对照品金丝桃苷(批号：111521-201809，纯度：94.9%)、异槲皮苷(批号：111809-201804，纯度：97.2%)、绿原酸(批号：110753-201817，纯度：96.8%)、槲皮素(批号：200081-201509，纯度：98.6%)、山柰酚(批号：110860-201611，纯度：95.5%)均购于中国食品药品检定研究院；对照品新绿原酸(批号：wkq18030107，纯度≥98%)、隐绿原酸(批号：wkq16081903，纯度≥98%)均购于四川省维克奇生物科技有限公司；乙醇、甲醇(分析纯，天津市富宇精细化工有限公司)；液相用磷酸(天津市科密欧化学试剂有限公司)、乙腈、甲醇(默克股份有限公司，色谱级)；水为超纯水(实验室自制)。

罗布麻叶来源于全国7个产地，经广东一方制药有限公司潘礼业主管中药师鉴定为夹竹桃科植物罗布麻ApocynumvenetumL.的干燥叶，具体产地信息见表1。

表1 16批罗布麻叶药材产地信息

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Waters CORTECS T3型色谱柱(100 mm×2.1 mm，1.6 μm)，以乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)为流动相，梯度洗脱(0～7 min，6%～12%A；7～11 min，12%～13%A；11～17 min，13%～15%A；17～20 min，15%～19%A；20～25 min，19%～30%A；25～28 min，30%～60%A；28～33 min，60%～75%A)；流速：0.3 mL·min-1；柱温：35 ℃；检测波长：360 nm；进样量：1 μL。

2.2 供试品溶液的制备

取本品粉末(过三号筛)适量，取约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加70%甲醇50 mL，称定质量，加热回流90 min，放冷，再称定质量，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3 对照品溶液的制备

精密称取对照品金丝桃苷2.122 mg、异槲皮苷2.209 mg、绿原酸2.064 mg、山柰酚2.056 mg，分别置于20 mL量瓶中，加甲醇制成质量浓度分别为100.688 9、107.357 4、99.897 6、98.174 0 μg·mL-1的对照品溶液；精密称取对照品新绿原酸2.346 mg，置于50 mL量瓶中，加甲醇制成质量浓度为45.981 6 μg·mL-1的对照品溶液；精密称取对照品隐绿原酸2.036 mg，置于25 mL量瓶中，加甲醇制成质量浓度为79.811 2 μg·mL-1的对照品溶液；精密称取对照品槲皮素2.145 mg，置于10 mL量瓶中，加甲醇制成质量浓度为211.497 0 μg·mL-1的对照品溶液。

2.4 特征图谱的建立及评价

2.4.1精密度试验 取S3药材粉末，精密称定，按2.2项下的方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件连续进样6次，测定，记录色谱图，以金丝桃苷峰为参照，计算各特征峰相对保留时间和相对峰面积，其中相对保留时间RSD为0.02%～0.18%，相对峰面积RSD为0.80%～1.36%，表明仪器的精密度良好。

2.4.2稳定性试验 取S3药材粉末，精密称定，按2.2项下的方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件，分别在0、2、4、8、12、24 h进样测定，以金丝桃苷峰为参照，计算各特征峰相对保留时间和相对峰面积，其中相对保留时间RSD为0.01%～0.34%，相对峰面积RSD为0.08%～2.37%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.4.3重复性试验 取S3药材粉末6份，精密称定，按2.2项下的方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进行测定，记录色谱图，以金丝桃苷峰为参照，计算各特征峰相对保留时间和相对峰面积，其中相对保留时间RSD为0.02%～0.17%，相对峰面积RSD为0.19%～2.94%，表明该方法重复性良好。

2.4.4特征图谱分析与评价

2.4.4.1特征图谱的建立 取16批罗布麻叶药材，按照2.2项下的方法制备供试品溶液，按2.1项下的色谱条件进行测定，记录色谱图。将16批药材特征图谱数据导入“中药色谱特征图谱相似度评价系统”(2012版)软件中，选择S1罗布麻叶的色谱图为参照图谱，以“平均数”法作为对照图谱生成方式，设定时间窗宽度为0.1 min，多点校正后，在全谱峰匹配模式下生成16个共有峰，并生成对照图谱R，见图1～2。

图1 16批罗布麻叶药材UPLC特征图谱

注：1.新绿原酸；2.绿原酸；3.隐绿原酸；7(S).金丝桃苷；8.异槲皮苷；15.槲皮素；16.山柰酚；图3同。图2 罗布麻叶药材UPLC对照图谱

根据对照品指认，确定了罗布麻叶特征图谱中峰1为新绿原酸、峰2为绿原酸、峰3为隐绿原酸、峰7为金丝桃苷、峰8为异槲皮苷、峰15为槲皮素、峰16为山柰酚，见图3。

注：A.罗布麻叶供试品(批号：S3)；B～H.对照品。图3 罗布麻叶供试品与对照品色谱图

2.4.4.2相似度评价 在“中药色谱特征图谱相似度评价系统”(2012版)中，系统根据各批次样品色谱图的共有模式生成对照图谱R，计算出S1～S16罗布麻叶药材特征图谱与对照图谱R的相似度分别为0.992、0.999、0.994、0.997、0.999、0.994、0.996、0.998、0.987、0.999、0.996、0.995、0.994、0.986、0.991、0.998，各批次药材与对照图谱之间的相似度均大于0.95，说明各批次药材的相似度良好。

2.4.4.3聚类分析 运用SPSS 20.0软件，以单位质量药材的16个共有峰峰面积为原始数据，采用组间平均数联结法，以余弦作为样品相似度的距离公式，对16批药材进行聚类分析，结果见图4。由结果可知，当16批样品分为4类时，Ⅰ类包括S4、S5、S10、S12、S16，即安徽省阜阳市的2批样品、湖南省邵阳市的1批样品和河南省驻马店市的2批样品聚为一类；Ⅱ类包括S9、S11、S15，即湖南省邵阳市1批样品、河南省南阳市1批样品、河南省驻马店市1批样品聚为一类；Ⅲ类包括S2、S3、S8，即四川省成都市2批样品、湖南省邵阳市1批样品聚为一类；Ⅳ类包括S1、S6、S7、S13、S14，即四川省成都市1批样品、安徽省阜阳市2批样品、河南省驻马店市2批样品聚为一类。各产地罗布麻叶药材离散于4类中，分布不集中，因此，需对其进行进一步分析。

图4 16批罗布麻叶样品聚类分析结果

2.4.4.4主成分分析 将16批罗布麻叶药材UPLC图谱中的共有峰峰面积除以药材的取样量，得到单位质量药材的峰面积；再借助SPSS 20.0统计分析软件进行主成分分析，得出相关矩阵的特征值及其方差，见表2，载荷图见图5。按照主成分对应的特征值>1的提取原则，提取了4个主成分，其中主成分1的特征值为6.919，方差贡献率为43.246%；主成分2的特征值为3.518，方差贡献率为21.990%；主成分3的特征值为2.030，方差贡献率为12.685%；主成分4的特征值为1.637，方差贡献率为10.232%。前4个主成分累积方差贡献率为88.154%，说明该4个主成分可代表罗布麻叶特征图谱共有峰的大部分信息。

表2 16批罗布麻叶样品主成分特征值及方差

图5 16批罗布麻叶样品主成分分析荷载图

由主要因子载荷矩阵(表3)可知，16个共有峰对应了影响主成分的16个变量，特征向量的数值及符号代表变量在主成分中的权重，权重越大，表明该化合物在药材主成分分析中作用越大。第一主成分主要反映了来自色谱峰1、6、11的信息，第二主成分主要反映了来自色谱峰7、8、15的信息，第三主成分主要反映了来自色谱峰4、9、12的信息，第四主成分主要反映了来自色谱峰10、13、14的信息，故仅用前4个主成分就可表示罗布麻叶药材UPLC数据的主要信息，是16批罗布麻叶药材差异性的主要影响因素。

表3 16批罗布麻叶样品主成分分析主要因子荷载矩阵

2.4.4.5不同产地罗布麻叶药材的综合评价 针对前4个主成分对罗布麻叶药材进行综合评价，计算综合得分，见表4。由结果可知，排名前9的样品中，河南省驻马店市4批、四川省成都市2批、安徽省阜阳市2批、湖南省邵阳市1批。总体来说，河南省驻马店市产的罗布麻叶整体上质量较优，但药材质量并不均匀，综合排名分布较分散；四川、安徽、湖南产的罗布麻叶综合排名分布较分散。

表4 不同产地罗布麻叶综合得分

2.5 含量测定

2.5.1线性关系考察 精密称定对照品金丝桃苷6.325 mg和异槲皮苷8.153 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，得金丝桃苷和异槲皮素混合对照品母液。分别精密吸取混合对照品母液0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，连同金丝桃苷和异槲皮苷混合对照品母液分别按照2.1项下色谱条件依次测定，记录峰面积。以峰面积为纵坐标(Y)，对照品质量浓度为横坐标(X)建立线性回归方程。金丝桃苷标准曲线为Y=7 411 511.0X+1 755.0，r=0.999 7，在15.038～601.508 μg·mL-1金丝桃苷质量浓度与峰面积线性关系良好；异槲皮苷标准曲线为Y=7 514 521.6X+3 520.8，r=0.999 7，在18.935～757.414 μg·mL-1异槲皮苷质量浓度与峰面积线性关系良好。

2.5.2精密度试验 取S3药材粉末，精密称定，按2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件连续进样6次，测定，金丝桃苷和异槲皮苷峰面积的RSD分别为2.08%、2.09%，表明仪器精密度良好。

2.5.3稳定性试验 取S3药材粉末，精密称定，按2.2项下的方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件分别于制备后0、2、4、8、12、24 h进样，测定，金丝桃苷和异槲皮苷峰面积的RSD分别为1.57%、1.55%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.5.4重复性试验 取S3药材粉末共6份，精密称定，按2.2项下的方法制备供试品溶液，按2.1项下的色谱条件进行测定，记录金丝桃苷和异槲皮苷的峰面积，分别计算药材中金丝桃苷和异槲皮苷的平均质量分数，金丝桃苷平均质量分数为0.370%(RSD=0.86%)，异槲皮苷平均质量分数为0.396%(RSD=0.72%)，表明重复性符合要求。

2.5.5加样回收率试验 精密称定对照品金丝桃苷9.036 mg和异槲皮苷8.847 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，得混合对照品母液。取50 mL锥形瓶，平行3组，每组3份，分别加入母液0.5、1.0、1.5 mL，用氮吹仪吹干后加入罗布麻叶药材0.25 g，精密称定，按2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进行测定，记录金丝桃苷和异槲皮苷的峰面积，计算金丝桃苷和异槲皮苷加样回收率，结果见表5，表明该方法准确度良好。

表5 罗布麻叶中金丝桃苷和异槲皮苷加样回收率试验结果

2.5.6样品测定 取16批罗布麻叶药材，分别按2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下的色谱条件进样测定，结果见表6。S1～S16中的金丝桃苷质量分数均大于0.30%，即16批药材都符合《中国药典》2020年版含量限度的要求。16批罗布麻叶药材金丝桃苷、异槲皮苷及总质量分数有一定的波动，但波动不大，说明不同产地的罗布麻叶药材金丝桃苷和异槲皮苷含量相对较稳定，差异较小。从各产地总质量分数均值来看，以安徽省阜阳市产的罗布麻叶总质量分数均值最高，为0.97%；其次是河南省驻马店市，为0.94%，两地总质量分数差异不大。

表6 16批罗布麻叶金丝桃苷和异槲皮苷质量分数 %

3 讨论

3.1 色谱条件及提取方法的选择

本实验建立同时测定罗布麻叶药材特征图谱及2个黄酮类成分含量的方法，在选择色谱条件时，考察了流动相体系(甲醇-0.1%磷酸、乙腈-0.1%磷酸)、流动相酸的种类(磷酸、甲酸、冰乙酸)、检测波长(275、360 nm)、色谱柱[Waters CORTECS UPLC T3(100 mm×2.1 mm，1.6 μm)、Waters HSS T3(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)、Agilent SB C18(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)]、柱温(33、35、37 ℃)及流速(0.28、0.30、0.32 mL·min-1)的影响。最终选择最佳色谱条件分别为乙腈-0.1%磷酸、360 nm、Waters CORTECS UPLC T3(100 mm×2.1 mm，1.6 μm)、35 ℃、0.30 mL·min-1。

通过单因素分析，分别考察了提取溶剂用量(25、50、100 mL)、提取溶剂(甲醇、70%甲醇、50%甲醇、乙醇、70%乙醇、50%乙醇)、提取方式(超声、加热回流)及提取时间(30、60、90、120 min)对罗布麻叶特征图谱及含量测定的影响，以确定最佳样品前处理方法。综合提取效果与经济效率，最终确定的前处理方法为用70%甲醇50 mL，加热回流90 min。

3.2 结果分析

本实验建立了不同产地罗布麻叶药材UPLC特征图谱方法，由于峰9与峰10之间的3个峰分离度较差，纯度较低，故只标定其余16个共有峰，指认了峰1为新绿原酸、峰2为绿原酸、峰3为隐绿原酸、峰7为金丝桃苷、峰8为异槲皮苷、峰15为槲皮素、峰16为山柰酚。各批次药材与对照图谱R之间的相似度均大于0.95；聚类分析将16批药材划分成4类，结合主成分分析，发现第一、二、三、四主成分的累积方差贡献率高达88.154%，该4个主成分可表示罗布麻叶药材UPLC数据的主要信息。并针对4个主成分对罗布麻叶药材进行综合得分评价，显示河南省驻马店市产地的罗布麻叶药材排名较靠前，4个产地的罗布麻叶综合排名分布较分散，说明罗布麻叶药材总体质量不够稳定。现代药理研究认为，罗布麻叶的主要活性成分为黄酮类成分，具有降压、调脂、抗氧化、抗病原微生物、增强免疫活性、抗肿瘤等作用，其中金丝桃苷、槲皮素和异槲皮苷是罗布麻叶降血压的主要活性物质[14-15]。在罗布麻叶药材UPLC特征图谱方法的基础上，由于槲皮素(峰15)峰面积较小、含量低，因此只测定了黄酮类中的主要成分金丝桃苷(峰7)和异槲皮苷(峰8)的含量。结果表明，药材中金丝桃苷和异槲皮苷含量波动不大，说明不同产地的罗布麻叶药材金丝桃苷和异槲皮苷含量较稳定，差异性较小。从总含量均值来看，以安徽省阜阳市和河南省驻马店市产罗布麻叶药材总含量较高。本研究为罗布麻叶药材的采购与质量评价提供了参考。