TIF1-γ重组蛋白的表达及其在抗TIF1-γ抗体ELISA检测方法中的初步应用

韩冠华 林晓涛 孟庆勇 何林 钱纯亘 程邦宁★ 徐军发★

特发性炎性肌病（idiopathic inflammatory my-opathy，IIM）是一组以对称性四肢近端肌无力为特征表现的系统性自身免疫性结缔组织病，基于临床症状及免疫病理特征，可将其分为不同的亚型，临床上常见的亚型是皮肌炎（dermatomyositis，DM）。随着研究的深入，陆续有学者发现IIM 患者血清中存在特异性的自身抗体，且此类抗体与IIM 患者的临床表现和预后相关，有助于指导临床医生为患者制定个体化的治疗方案［1-2］。其中抗转录中介因子1-γ（TranscriptionalIntermediary Factor 1-gamma，TIF1-γ）抗体是TARGOFF 等［3］于2006年通过免疫沉淀法（immunoprecipitation，IP）首次在肌炎患者血清中发现的一种自身抗体，后续的多项研究指出抗TIF1-γ 抗体可作为监测DM 患者继发恶性肿瘤的生物标志物［4］。检测抗TIF1-γ 抗体的金标准是IP，但由于该方法涉及培养及使用细胞，步骤繁琐，且需要使用放射性标记物，并不适用于临床检测。目前临床上检测抗TIF1-γ 抗体最常用的是抗肌炎抗体谱IgG 检测试剂盒（欧蒙印迹法），但基于不同方法学之间特异性和敏感度会存在一定差异，应结合临床症状和其它检测方法（如ELISA、化学发光法等）对检测结果进行综合分析［5-6］。基于上述背景，本研究将分析TIF1-γ 重组蛋白作为诊断抗原的临床应用价值，为开发抗TIF1-γ IgG 抗体检测方法提供核心原料。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 仪器与试剂

DH10Bac 感受态细胞、SF9 细胞由本实验室保存；质粒提取试剂盒、脂质体转染试剂盒购自Ther-mo 公司；Flag 层析填料购自MBL 公司；抗Flag 标签鼠单克隆抗体购自康为世纪生物科技有限公司；封闭液、偶联物稳定剂、TMB 底物购自湖州英创生物科技有限公司；鼠抗人IgG-HRP 购自菲鹏生物股份有限公司；PCR 仪、酶标仪为BioRad 公司产品。

1.1.2 标本来源

抗TIF1-γ IgG 抗体阳性血清21 例，抗Jo-1 IgG 抗体、抗Scl-70IgG 抗体、抗双链DNA（dsDNA）抗体、类风湿因子（RF）和抗核抗体（ANA）各5 例，共25 例（疾病对照组）以及健康体检者血清44 例（健康对照组），由本实验室收集并保存，均已分离血清并保存在-80℃冰箱。

1.2 方法

1.2.1 表达质粒pFastBac1-TIF1-γ 的构建

从Uniprot 数据库检索得到人TIF1-γ 氨基酸序列（ID：Q9UPN9），按照昆虫杆状病毒表达系统偏好对TIF1-γ 序列进行密码子优化，在C-端同时引入3×Flag 序列，委托通用生物系统（安徽）有限公司合成。合成的TIF1-γ 基因为3 462 bp，其中5′端含BamHI 酶切位点，3′端含XhoI 酶切位点，经BamHI和XhoI 双酶切后插入到pFastBac1 载体，表达质粒经测序及双酶切鉴定确认构建的正确性。

1.2.2 TIF1-γ 重组蛋白的表达与纯化

将pFastBac1-TIF1-γ 转化DH10Bac 感受态细胞，使用LB 琼脂平板（含50 μg/mL 卡那霉素、10 μg/mL 四环素、7 μg/mL 庆大霉素、100 μg/mL X-gal 和40 μg/mL IPTG）进行蓝白斑筛选，分别挑取蓝斑和白斑扩大培养，培养物用于提取重组杆粒，具体操作参考质粒提取试剂盒说明书。使用M13 Forward/M13 Reverse 引物对重组杆粒进行PCR 鉴定。将鉴定正确的Bacmid-TIF1-γ 转染至SF9 细胞，27℃培养72 h，500 g 离心15 min 收集上清即为第一代重组病毒（P1）；P1 用于感染正常SF9 细胞，扩增病毒得到P2；通过相同的方法得到P3，将P3 加入到悬浮培养的SF9 细胞，27℃，110 rpm 培养72 h，收获细胞并进行离心和超声处理，收集细胞裂解液，通过Flag 亲和层析柱进行纯化，收集表达产物进行SDS-PAGE 和Western-Blot 分析。

1.2.3 抗TIF1-γ IgG 抗体-ELISA 的建立

TIF1-γ 重组蛋白包被96 孔板（400 ng/孔），商品化封闭液封闭；血清按1∶100 稀释，每孔100 μL，37℃孵育1 h；PBS-T 洗板3 次后加入1∶10 000稀释的HRP 标记的鼠抗人IgG，100 μL 每孔，37℃孵育30 min；再次清洗后，加入TMB 底物，37℃孵育10 min；最后加入终止液，酶标仪读取OD 值。

1.2.4 统计学处理

使用SPSS 26.0 统计分析软件对数据进行处理，通过绘制受试者工作特征曲线（receiver opera-tion characteristic，ROC），确定自建抗TIF1-γ IgG抗体-ELISA 检测临界（cut-off）值。

2 结果

2.1 表达质粒pFastBac1-TIF1-γ 的构建及鉴定

电泳结果显示出现两条特异性条带，其中一条位置约在3 400 bp 处为TIF1-γ 基因，另一条位置约在4 700 bp 处为载体pFastBac1。见图1。

图1 pFastBac1-TIF1-γ 双酶切鉴定结果Figure 1 Restriction enzyme identification of pFastBac1-TIF1-γ

2.2 重组杆粒Bacmid-TIF1-γ 的鉴定

已发生转座的Bacmid- TIF1-γ 条带位置约在5 700 bp 处，未发生转座的Bacmid 条带位置约在300 bp 处。见图2。

图2 Bacmid-TIF1-γ 扩增结果Figure 2 PCR result of the Bacmid-TIF1-γ

2.3 TIF1-γ 重组蛋白表达和纯化

表达产物经SDS-PAGE 分析，目的蛋白条带位置约在150 kD 处。Western-Blot 结果显示，该目的条带能与抗Flag 标签抗体特异性结合。见图3～4。

图3 表达产物的SDS-PAGE 分析Figure 3 SDS-PAGE analysis of expression protein products

图4 TIF1-γ 重组蛋白Western-Blot 检测Figure 4 The detection of TIF1-γ recombinant protein by Western Blot

2.4 抗TIF1-γ IgG 抗体-ELISA 检测结果

结果显示，OD 值=0.273 时约登指数最大，因此把cut-off 值选定为0.273，此时敏感度为100%，特异性为97.1%。见图5。

图5 抗TIF1-γ IgG 抗体-ELISA ROC 曲线Figure 5 ROC curve of anti-TIF1-γ antibody-ELISA

3 讨论

TIF1-γ 蛋白属于TRIMs（Tripartite motif-con-taining）家族蛋白，具有一个RING 结构域，可作为泛素连接酶E3 发挥作用，在肿瘤发生过程中扮演着重要的角色，如参与凋亡相关蛋白P53 的调控、抑制TGF-β 信号通路的活性等，推测这些蛋白的自身抗体可能是肿瘤发生过程中产生的，从而促进癌症的发生［7-8］。抗TIF1-γ 抗体可作为监测IIM 患者继发恶性肿瘤的生物标志物。临床上对于抗TIF1-γ 抗体阳性的IIM 患者，应注意密切随访，及时进行相关的肿瘤检测。IP 被视为检测该类自身抗体的金标准，但它并不适用于常规的临床检测，面对不断增长的患者数量，建立有效、可靠、快速和简便的抗TIF1-γ 抗体检测方法非常有必要。为了验证现有试剂的性能以及开发出更符合临床需求的抗TIF1-γ 抗体检测试剂，Aggarwal 等［9］以OriGene 公司的纯化全长TIF1-γ重组蛋白作为包被抗原建立了基于ELISA 的抗TIF1-γ 抗体的检测方法与IP 进行比较，总体符合率为93.9%，有高度的一致性（κ=0.87）。Mahler 等［10］用欧蒙印迹法与IP 共同测试一批DM 患者血清，其中抗TIF1-γ 抗体项目总体符合率为94.9%，κ=0.71（P<0.05），一致性较好。上述研究表明，以欧蒙抗肌炎抗体谱IgG 检测试剂盒为代表的IB 检测方法与金标准IP 有较好的一致性，同样的，以ELISA 为原理所建立的检测方法也有望替代IP。

本研究测试过程中发现2 例与欧蒙印迹法测试结果不符的样本，推测出现不符的原因有以下几点，一是包被抗原的纯度。本研究得到的重组蛋白经纯化后通过SDS-PAGE 分析，存在较明显的非目的条带，猜测是目的蛋白降解产物，是否因此而产生了非特异性结合还有待验证。二是固相载体材料的不同。ELISA 和IB 的固相材料分别为聚苯乙烯和硝酸素纤维膜，因此包被工艺可能会存在差异。如将蛋白包被在硝酸素纤维膜后，一般需要进行一定时间的烘干，此过程对蛋白的活性可能会造成一定的影响，而蛋白质与酶标板的结合则是通过物理吸附作用，包被条件相对温和。三是反应体系的不同。封闭液和缓冲液的选择，如盐离子的浓度、表面活性剂的种类及用量、是否需要添加额外的蛋白成分或阻断剂等都有可能对测试结果产生影响。四是不同方法学之间特异性和敏感度会存在一定差异，且抗TIF1-γ IgG 抗体的检测目前没有可溯源的国际标准品，对于测试结果有存在争议的样本，应参考不同技术平台的检测结果并结合患者临床表现进行综合分析［11-12］。综合上述四个方面，后续需通过金标准或第三方ELISA 试剂验证两例假阳性样本是否为“真阴性”。另外有文献报道，两种自身抗体各自对应的靶抗原（Mi-2β 和TIF1-γ）有相似的氨基酸序列，抗Mi-2β 抗体会和TIF1-γ 蛋白结合，出现交叉反应［13］。后续仍需收集并测试更多疾病对照组样本，探讨是否存在能与本研究制备的TIF1-γ 重组蛋白结合的自身抗体，进一步评估自建ELISA 的特异性。综上所述，本研究得到的TIF1-γ 重组蛋白在体外诊断试剂研发方面具有较好的应用前景，为开发抗TIF1-γ IgG 抗体检测方法提供了核心原料。基于此重组蛋白初步建立的抗TIF1-γ IgG 抗体-ELISA 是一种特异和灵敏的血清学检测方法，对临床诊断和治疗皮肌炎患者有一定的应用价值，可作为现有免疫印迹法试剂的良好补充。