耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌的耐药基因及同源性分析

陈晨 周俊英 李一荣 杨京冬

近年来由于抗菌药物的不合理使用，使得临床分离的细菌对抗菌药物的敏感性逐渐降低，给临床抗感染治疗带来困难。目前临床上最受重视的是产超广谱β-内酰胺酶的革兰阴性杆菌，其中以肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌等多重耐药的肠杆菌科细菌与人们的生活紧密相关［1-2］，碳青霉烯类药物不合理使用导致出现了耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌（Carbap-enem resistant Enterobacteriaceae，CRE）［3-4］。肠杆菌基因间重复序列（enterobacterial repetitive intergen-ic consensus sequence，ERIC）广泛存在于肠道细菌中，长约124～127 bp［5］，其中存在高度保守长约40 bp 的核心序列，两个重复序列在肠道细菌基因组中存在着属、种、株水平上的分布和拷贝数量的差异，这些重复序列本身在进化过程中具有较强的保守性，ERIC-PCR 具有快速、简单、分辨率高和使用设备简单等优点［6］，使得它在细菌分类、分子微生物生态学研究中有着广阔的应用前景。本研究采取微生物鉴定药敏系统进行CRE 的判定，挑选对亚胺培南不敏感的肠杆菌科细菌，改良Hodge 实验进行表型筛选，PCR 检测CRE 菌株的五种常见耐药基因（KPC、VIM、IMP、NDM和OXA）。选取17株分离自ICU 的基因型均为KPC 的耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌（Carbapenem resistant Enterobacteria-ceaeKlebsiella pneumoniae，CRKP）进行ERIC-PCR和同源性分析，判断重症医学科室内的CRKP 菌株是否为同一亚型或同一克隆株，从而了解细菌的流行病学特征。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源

通过法国梅里埃VITEK 2 COMPACT 对本院2017年2月至2017年11月间60 株耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌（CRE）进行鉴定，药敏结果参照CLSIM100（2017），且改良Hodge 实验［7］初筛结果为阳性；细菌经鉴定后置-40℃恒温冰箱中保存，改良Hodge 实验以大肠埃希菌ATCC25922为质控菌株。

1.1.2 试剂和仪器

美罗培南、亚胺培南、厄他培南由英国OXOID公司提供，细菌基因组DNA 提取试剂盒（离心柱型）DP302，Taq 酶、dNTPs、MgCl2、10x buffer（Mg+2 plus/free）DNA 100 bp/DS5000 Marker，由天根生化科技（北京）有限公司提供，PCR 引物序列由北京擎科新业生物技术有限公司合成。Bio-Rad 普通PCR 仪（Bio-Rad 公司/美国），NanoDrop 2000（Thermo Scientific/美国），电泳仪（PAC3000）和紫外凝胶成像及分析系统仪（Bio-Rad 公司/美国）。

1.2 方法

1.2.1 细菌的选取

选取60 株Hodge 实验为阳性的CRE 菌株，标本的分离培养与鉴定操作依据《全国临床检验操作流程》（第四版）［8］进行。

1.2.2 改良Hodge 实验

以厄他培南为底物纸片进行改良Hodge 实验，阴性结果再用美罗培南与亚胺培南纸片。以大肠埃希菌ATCC25922 为阴性对照，若任一药敏纸片被测菌株与大肠埃希菌ATCC25922 抑菌圈交汇处出现大肠埃希菌生长增强的现象，即可记录为改良Hodge 实验结果阳性。

1.2.3 细菌DNA 提取

按照天根细菌基因组DNA 提取试剂盒说明书进行，实验方法可见天根生化科技（北京）有限公司生产的细菌基因组DNA 提取试剂盒（离心柱型），DP302 型号说明书。

将DNA 收集到离心管中，按照NanoDrop 2000 微量紫外分光光度计中文操作手册检测DNA 浓度、纯度并记录。并将提取DNA 作为后续PCR 反应模板于-40℃冰箱中保存备用。

1.2.4 PCR 引物合成序列

KPC、IMP、OXA-48、VIM、NDM 5 种PCR 引物序列见表1。

表1 碳青霉烯酶基因所用的PCR 引物序列Table 1 PCR primer sequence of carbapenase gene

1.2.5 耐药基因扩增

扩增体系：Buffer 2.5 μL，Mg2+2.5 μL，dNTPs 1 μL，引物F 和R 各1 μL，Taq（5 U/μL）1.5 μL，DNA 2 μL，H2O214.5 μL。IMP 的反应条件为：94℃变性10 min；94℃30 s，55℃40 s，72℃50 s，36个循环；72℃延伸5 min；KPC 的反应条件为：94℃变性10 min；94℃30 s，56℃40 s，72℃50 s，36 个循环；72℃延伸5 min；OXA、VIM 及NDM 的反应条件为：94℃变性10 min；94℃30 s，58℃40 s，72℃50 s，36个循环；72℃延伸5 min。电泳参数为90 V，20 min。

1.2.6 肠杆菌基因间重复序列PCR 与同源性分析

采用肠杆菌基因间重复一致序列PCR（Enterobacterial repetitive intergenic consensus PCR，ERIC-PCR）进行基因扩增，ERIC-2 单引物序列为AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG（5′-3′）［9］。

反应体系：Buffer 2 μL，Mg2+1.25 μL，dNTPs 1.6 μL，引物1 μL，Taq（5 U/μL）0.6 μL，DNA 1 μL，H2O212.55 μL；反应条件为：94℃变性5 min；94℃30 s，44.5℃45 s，72℃2 min，35 个循环；72℃延伸10 min。选取17 株基因型为KPC 的耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌（CRKP）进行同源性分析，采用生物信息分析软件（Bionumerics）图像分析软件对其进行聚类分析，判断标准：按照Tenover［10］的判断标准，①图谱完全相同为一个型；②相差一个带为同一型的不同亚型；③相差2～3 个带为紧密相关；④相差4～6 个带为可能相关；⑤相差7 个以上条带为无亲缘关系。

2 结果

2.1 细菌的种类与临床分布

60 株CRE 中包括肺炎克雷伯菌53 株（88.33%），大肠埃希菌3 株（5%），阴沟肠杆菌3 株（5%），弗氏柠檬酸杆1 株（1.67%）；标本以痰和纤支镜灌洗液为主，痰和灌洗液分离出28 株，构成比为46.67%，其次是尿液为16 株，构成比为26.67%，伤口分泌物和血液为4 株，构成比为6.67%、导管尖端和引流液，为3 株，构成比为5.00%；科室分布主要是重症医学科，为21 株，其次新生儿科检出7 株，呼吸及危重症医学科检出8 株，血液科检出5 株，泌尿外科检出3 株，其他科室检出16 株。

2.2 不同底物的改良Hodge 实验结果

以厄他培南（10 μg/片）纸片为底物对60 株CRE 菌株做改良Hodge 实验，检出57 株厄他培南改良Hodge 实验阳性株。改良Hodge 试验结果。见图1。

图1 改良Hodge 试验结果Figure 1 Modified Hodge test results

再对剩余3 株未检测出厄他培南底物纸片改良Hodge 实验阳性菌株，分别同时进行亚胺培南与美罗培南改良Hodge 实验检测，结果见表2。

表2 3 株改良Hodge 实验阴性的菌株结果Table 2 Results of 3 strains of modified Hodge negative

综合3 种底物纸片结果，厄他培南改良Hodge实验对产KPC型A 类碳青霉烯酶的菌株阳性率为100%（50 株/50 株），33.3%（3 株/9 株）的产NDM型B 类金属β-内酰胺酶的菌株在厄他培南改良Hodge 实验中结果为阴性，但补充亚胺培南与美罗培南改良Hodge 实验后仍可鉴定为阳性株。

2.3 耐药基因扩增结果

60株CRE中有58株扩增出相关耐药基因。KPC有50 株占86.21%，NDM 有9 株占15.52%，IMP 有2株占3.45%。同时扩增出KPC和IMP的有2 株占3.45%，同时扩增出KPC和NDM的有1 株占1.72%，其中60株均未扩增出OXA-48、VIM。见图2。

图2 五种耐药基因扩增结果Figure 2 PCR results of five drug-resistant genes

2.4 ERIC-PCR 同源性分析

应用bionumerics 软件进行聚类分析，结果如图3所示。以相关系数（±0.50～±0.80）为显著相关，相关系数（±0.80～±1.00）为高度相关。17 株CRKP 的扩增结果可聚为3 类。菌株14、16、10、13、17、8 可聚为一大类：其中菌株8 和17 亲缘关系最近，相关系数最高达到了0.76，菌株14 和16 相关系数达到了0.75，菌株10 和16 相关系数达到了0.71，这3 对菌株表现出较高的同源性；菌株11、15聚为一类：相关系数为0.57，显著相关；菌株2、4、12、1、5、6、3、9、7 另聚为一大类：其中菌株1 和12相关系数达到0.72，表现出较高的同源性。见图3。

图3 CRKP 的同源性分析Figure 3 Romology analysis of CRKP

3 结论

60 株CRE 菌株中，以肺炎克雷伯菌为主占88.33%；标本类型主要为呼吸道标本（痰及支气管灌洗液）占46.67%，尿液、血液等样本均有分离，这提示可能存在多部位感染；科室以重症监护室为主占35%，广谱抗菌素的使用及支气管镜等侵入性操作是感染CRE 的主要高危因素［11］，医院应加强院内感染管理工作，通过隔离感染者、对细菌耐药进行网报监管、手卫生、以及加强病区环境与器材的消毒等措施控制院内感染的发生。

CRE 的耐药基因型以KPC（86.21%）和NDM（15.52%）为主，这与陆［12］等的以KPC和IMP结论有所不同，推测可能与地域有关。本研究发现CRE 菌株存在一定的多重耐药基因情况，58 株CRE 菌株中，有3 株同时存在2 种耐药基因占5.17%，CRE 菌株的多重耐药将给临床用药治疗带来更大困难与风险，临床医生在治疗时应慎重使用抗菌药物。另有两株菌株未检出KPC、NDM、IMP、VIM与OXA这五种基因型中的任何一种，可能属于少见的耐药基因型，有待进一步研究。

自ICU 分离的17 株CRKP 表现出较高的同源性，相关系数最高的2 菌株达到0.76，但未见同一克隆株的暴发流行，这提示医院仍要继续加强院内感染的监测与防护，加强医护人员的培训管理，一旦发现患者有耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌感染或定植，应将该患者进行隔离，规范抗菌药物的合理使用，同时对CRKP 的流行趋势进行长期监控从而避免多重耐药菌株所产生的“无药可用”的严重后果。