五种农药及其二元、三元组合对人肝癌HepG2细胞的联合毒性

王天彩, 陈 晨, 马朦朦, 杨 茜, 李 耘, 钱永忠

(中国农业科学院 农业质量标准与检测技术研究所，北京 100081)

农药在农业生产及农业环境保护中起到重要的作用[1]。中国农药年用量183万吨，农药市场销售额仅居于巴西、美国、日本、法国之后，占全球5.23%[2]。但目前使用的许多农药都具有相当的持久性和毒性，加之存在使用不当等现象，农药在不同基质中的检出和超标现象已引起人们的广泛关注[3-5]。Hvězdová 等对捷克共和国75个耕地土壤中的53种农药和15种转化产物进行了检测分析，检出率高达98.7%[6]。农药品种繁多，复配农药占很大比例，多种农药混合使用、盲目使用或者滥用致使农产品中多农药残留现象比较突出。Lozowicka等在测定波兰水果中的农药残留时发现，64.2%的样本中含有可检出的农药残留，其中13%的样本农药含量超过欧盟规定的最高残留限量 (MRL)，高达46.3%的样本中含有2～8种农药残留[7]。Fosu和Bakirci等分别对2010—2012年间加纳和土耳其果蔬中的农药含量进行监测。结果显示，多农药残留样本分别高达88.40%和20.03%，显著高于32.40%和9.21%的超标样本[8-9]。由此可见，相对于农药超标，农药多残留现象更不容忽视，农药多残留带来的安全隐患更是不容小觑。

农药能够杀死、击退或抑制生物生长[10]。一些农药不仅针对一类害虫，对其他生物也具有相当的毒性。残留的农药会被部分生物摄入或者通过其他方式吸入，并在体内积累，再通过食物链转移到其他生物体内，最终进入人体[11]。农药暴露会对人体产生肝脏、神经、免疫、基因等毒性，一些农药还具有内分泌干扰效应[12-16]。混合农药各组分之间可能产生生物学效应，呈现十分复杂的交互作用。Du等应用血浆代谢组学评估了敌敌畏、高灭磷、乐果及甲拌磷4种有机磷农药对雄性Wistar大鼠的毒性作用。结果表明，4种药物在对大鼠无损害作用水平下混合可产生联合效应，会引起机体氧化应激和肝肾功能障碍[17]。综上所述，多农药残留可能产生复杂的联合毒性效应，但目前国内外在制定农药限量标准时往往仅考虑单一或一类农药的危害，而忽略了混合污染带来的联合毒性问题[18-20]。因此，评估多农药残留的潜在联合毒性和量化风险，成为环境科学家、风险评估人员和监管机构面临的主要挑战。

肝脏是外源性物质代谢的重要场所，其中人肝癌HepG2细胞是一种用于毒性研究的模型细胞株，常用于药物代谢和肝毒性研究[21-22]。CCK-8(Cell Counting Assay Kit-8) 法由于其卓越的灵敏度和便捷的操作，已广泛用于药物的细胞毒性评估[23-25]。基于近几年国家食品及农产品质量安全风险监测和风险评估数据，本研究以生菜中残留的苯醚甲环唑、氯氰菊酯、烯酰吗啉、氯氟氰菊酯和啶虫脒5种农药及其典型二元、三元混合物为研究对象，采用CCK-8法探究农药单剂及混合物对HepG2细胞的增殖抑制毒性，应用浓度相加(concentration addition，CA)、独立作用 (independent action，IA) 和联合指数 (combination index，CI) 模型，通过单个农药的细胞毒性作用推导出混合物联合效应，进一步探究农药混合物对细胞凋亡的诱导作用。其中典型二元组合包括烯酰吗啉 + 苯醚甲环唑、烯酰吗啉 + 氯氰菊酯和烯酰吗啉 + 啶虫脒；典型三元组合包括烯酰吗啉 + 苯醚甲环唑 +氯氰菊酯、烯酰吗啉 + 苯醚甲环唑 + 氯氟氰菊酯及烯酰吗啉 + 氯氰菊酯 + 啶虫脒。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

98.7%烯酰吗啉(dimethomorph)、97.2%苯醚甲环唑( difenoconazole)、94.3%氯氰菊酯(cypermethrin)、98.3%氯氟氰菊酯(cyhalothrin)和97.8%啶虫脒(acetamiprid)农药标准品 (德国Dr. Ehrenstorfer公司)；DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) 培养基、胎牛血清、胰蛋白酶 (0.25 Trypsin-EDTA)、磷酸盐缓冲液 (PBS)、青霉素-链霉素溶液和0.4%台盼蓝染液 (美国Thermo Fisher公司)；CCK-8试剂盒 (Dojindo日本同仁化学公司)；细胞凋亡试剂盒 (美国BD-Pharmingen公司)；Hoechst染料 (美国Invitrogen公司)；二甲基亚砜 (DMSO)(美国Sigma公司)。

CKX41SF倒置显微镜 (奥林巴斯中国有限公司)；M200 PRO多功能酶标仪 (美国TECAN公司)；Thermo Forma 311直热式二氧化碳恒温培养箱 (美国Thermo Fisher公司)；HHS电热恒温水浴锅 (上海博迅实业有限公司医疗设备厂)；IKAMS3 涡旋振荡器 (德国IKA公司)；TDZ4-WS低速自动平衡离心机(上海卢湘仪离心机仪器有限公司)；IC1000 Countstar全自动细胞计数仪 (美国Countstar公司)；OPRT1168高内涵筛选系统 (美国PerkinElmer公司)。

1.2 试验方法

1.2.1 细胞培养 HepG2细胞使用DMEM培养基(添加10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素双抗)，在37 ℃、饱和湿度及5% CO2条件下进行恒温培养。当细胞铺满培养瓶底面积约至90%时，用胰蛋白酶进行消化，以1: 2的比例进行传代。

1.2.2 染毒液配制 在超净台中，将农药标准品用DMSO稀释成一定浓度的母液，用不含血清的培养基逐级稀释至所需浓度用于后续试验，其中保证DMSO最终含量小于0.1%。混合物中各组分联合暴露方式为等毒性效应暴露。

1.2.3 细胞活力测定 调整细胞密度至每毫升3 ×105个细胞，在96孔板中每孔加入100 μL细胞悬液，在培养箱中培养24 h后，将旧培养液吸出换为不同浓度的染毒液，继续孵育24 h。向每孔中加入10 μL CCK-8溶液，孵育1 h后用酶标仪测定其在450 nm处的吸光度。按 (1) 式计算抑制率 (I)。

(1)式中：As为处理孔吸光值 (含有细胞和毒性物质的培养基)；Ab为对照孔吸光值 (含有细胞、没有毒性物质的培养基)；Ac为空白孔吸光值(不含细胞和毒性物质的培养基)。

1.2.4 基于CA、IA和CI模型的联合毒性效应评估 目前，国际上广泛认可的混合物联合毒性评估模型主要有CA和IA模型[26-27]。CA模型基于混合物成分具有相同或相似的作用模式的假设，通过公式 (2) 计算[26]。

(2)式中：ECx,mix是引起x%效应时的混合物浓度；ECx,i为第i个成分单独存在并引起与混合物相同的效应x%时的浓度；pi为第i个成分在混合物中的相对质量比。

IA模型是基于混合物中各组分具有不同的作用模式的假设，计算公式为 (3)[26]。

(3)式中：cmix和E(cmix)分别是混合物的总浓度和总效应；E(ci)表示第i个成分对混合物中ci浓度的影响。

Chou等通过多年的理论研究与实验验证，提出了基于半数效应方程但不依赖于作用模式的CI模型来评估混合物毒性相互作用，并已广泛地应用于药物组合研究[28]。基于药物半数效应浓度(median effective concentration，EC50) 选择5个浓度梯度 (0.25 × EC50、0.5 × EC50、EC50、2 × EC50和4 × EC50) 等毒性配比组成联合药物体系，评估混合药物相互作用的类型及程度，计算方法见 (4) 式[27]。

(4)式中：ECx,mix为混合物产生x%效应时的浓度；ECx,i为第i个成分单独存在并引起与混合物相同的效应x%时的浓度；pi为混合物中第i个组分的相对质量比；CIxcomp是根据混合物的实验毒性曲线计算出的混合物在x%效应水平下的组合指标值。CI ＜ 1，CI = 1和CI ＞ 1分别表示协同作用，相加作用和拮抗作用。当混合物发生协同作用时，可计算出每个农药单剂的剂量减少指数(dose reduction index，DRI)。DRI衡量的是在给定的效应水平上与单独使用每种农药的剂量相比，协同组合中每种农药的剂量可减少的倍数[29-30]。

1.2.5 细胞凋亡毒性实验 为探究各农药单剂和混合物对细胞凋亡的影响，基于细胞增殖毒性实验结果，选取各农药单剂的0.25 × EC50、0.5 ×EC50和EC50值作为凋亡实验暴露浓度。采用标记异硫氰酸荧光素 (fluorescein isothiocyanate，FITC)的Annexin V作为荧光探针与碘化丙啶 (propidium iodide，PI)、Hoechst染料联合使用，利用高内涵筛选系统进行检测，以测定农药单剂及混合物对细胞凋亡的影响[31-32]。操作方法为：调整细胞密度至每毫升3 × 105个细胞，在96孔黑板中每孔加入100 μL细胞悬液，先将培养板在培养箱中培养24 h，再将旧培养液吸出换为不同浓度的染毒液，继续孵育24 h。用PBS将FITC染料稀释10倍、PI和Hoechst染料稀释1 000倍后组成混合染料，每孔加入100 μL，37 ℃孵育20 min，PBS清洗3遍后进行高内涵扫描。所有操作均在避光条件下进行。

1.2.6 数据处理 使用SPSS分析并处理数据，将结果表示为平均值 ± 标准差。通过Origin 9.1和Excel软件绘制图表，并应用CompuSyn软件分析混合农药联合毒性效应。

2 结果与分析

2.1 农药单剂及组合对HepG2细胞增殖毒性的影响

农药单剂及混合物对HepG2细胞增殖抑制毒性的剂量-效应曲线如图1所示。在24 h内，所有农药单剂及二元组合对HepG2细胞增殖的抑制作用随农药浓度的增大呈S型曲线变化，而细胞增殖抑制率先迅速升高，之后缓慢升高 (图1A-B)。基于剂量-效应曲线拟合出5种农药单剂的EC50值，其中苯醚甲环唑的增殖抑制毒性最强，EC50值为 (24.72 ± 4.29) μmol/L，其余农药的毒性顺序为：烯酰吗啉 ((38.14 ± 2.08) μmol/L) ＞ 氯氟氰菊酯 ((43.04 ± 1.65) μmol/L) ＞ 啶虫脒 ((74.27 ± 5.77)μmol/L) ＞ 氯氰菊酯 ((127.88 ± 4.07) μmol/L)。在烯酰吗啉 + 苯醚甲环唑 + 氯氰菊酯和烯酰吗啉 + 氯氰菊酯 + 啶虫脒2种三元组合联合暴露模式下，随着农药混合物浓度的增大，其对HepG2细胞增殖的抑制作用逐渐增强，表现为明显的剂量-效应关系 (图1C)。当联合暴露农药浓度在60 μmol/L以下时，随着烯酰吗啉 + 苯醚甲环唑 + 氯氟氰菊酯组合农药浓度增大，HepG2细胞的增殖抑制率并未出现明显降低，但随着农药浓度增大，该农药组合对 HepG2 细胞增殖的抑制作用呈现先迅速升高，至150 μmol/L后再缓慢升高的趋势。

2.2 农药组合对细胞增殖毒性联合效应评估

2.2.1 CA、IA和CI模型对农药联合毒性的预测

图2显示CA、IA和CI模型预测以及试验测得剂量-效应曲线。比起CA和IA模型，在混合农药毒性预测方面，CI模型预测值更接近实验测定值。因此CI方法能够更准确地预测混合物的毒性。

2.2.2 基于CI模型的联合效应评估 为探究农药组合之间相互作用类型 (协同作用、拮抗作用或相加作用)，根据CI模型评估农药组合对细胞增殖毒性效应和CI指数之间的关系。结果 (图3) 表明，在试验浓度范围内，所有二元组合在低效应区呈拮抗作用，高效应区呈协同作用；三元组合烯酰吗啉 + 苯醚甲环唑 + 氯氟氰菊酯在整个浓度范围内表现为拮抗作用，而烯酰吗啉 + 苯醚甲环唑 + 氯氰菊酯和烯酰吗啉 + 氯氰菊酯 + 啶虫脒联合效应为低浓度协同、高浓度拮抗。

如图4所示：当效应水平为60%时，烯酰吗啉 + 苯醚甲环唑 + 氯氰菊酯混合物联合效应从协同转为拮抗；同样地，当效应水平为18%时，烯酰吗啉 + 氯氰菊酯 + 啶虫脒混合物联合效应从协同转为拮抗。

为量化混合农药之间的协同作用，对低毒性效应10%、20%水平下三元混合物中各组分的DRI值进行分析。如表1所示，对于烯酰吗啉 +苯醚甲环唑 + 氯氰菊酯和烯酰吗啉 + 氯氰菊酯 +啶虫脒，10%毒性水平下各农药单剂DRI值范围在3.36～35.82之间。其中农药单剂氯氰菊酯的DRI值显著高于其他农药，说明上述两个三元组合表现出协同效应时，起决定性作用的农药单剂是氯氰菊酯。在20%毒性水平下，三元组合烯酰吗啉 + 苯醚甲环唑 + 氯氰菊酯CI值为0.63，联合作用为协同效应，各农药单剂DRI值范围在3.25～6.99之间；而烯酰吗啉 + 氯氰菊酯 + 啶虫脒混合物CI值为1.43，表现为拮抗效应，其中3种农药烯酰吗啉、氯氰菊酯和啶虫脒的DRI值分别是1.88、4.04和1.54，表明啶虫脒在三元混合物中毒性较弱。

表1 三元农药组合对HepG2细胞增殖抑制毒性的联合作用Table 1 The combined effects of ternary mixtures on HepG2 cell growth inhibitory toxicity

2.3 农药单剂及组合对HepG2细胞凋亡的影响

空白组及苯醚甲环唑在EC50值浓度诱导处理下的HepG2细胞高内涵荧光成像结果如图5A所示。与空白组相比，苯醚甲环唑单独处理组表现出明显的细胞凋亡诱导作用 (P＜ 0.01)，当浓度为24.72 μmol/L时，细胞早期凋亡率高达90.11%，晚期凋亡率高达19.20%。如图5B所示，其余农药单剂同样可以造成HepG2细胞凋亡率显著提高(P＜ 0.01)，浓度越高，诱导作用越强，呈剂量依赖性。三元组合烯酰吗啉 + 苯醚甲环唑 + 氯氰菊酯、烯酰吗啉 + 氯氰菊酯 + 啶虫脒与空白组相比同样表现出显著的凋亡诱导作用。随着药物浓度增大，烯酰吗啉 + 苯醚甲环唑 + 氯氰菊酯对HepG2细胞的凋亡毒性明显增强，即该农药组合对HepG2细胞凋亡的诱导作用表现出明显的剂量-效应关系。对于三元组合烯酰吗啉 + 氯氰菊酯 + 啶虫脒，在20.02～80.10 μmol/L浓度范围内，其诱导凋亡水平对比于农药单剂显著提升 (P＜ 0.01)，表现出协同效应，这与CI模型预测的混合物联合效应相同。

3 结论与讨论

近年来，农产品中多种农药共存的现象频繁出现，因其可能会产生难以预测的毒性效应而引起人们的广泛关注。本研究测定生菜中高频检出的农药混合物在HepG2细胞内的毒性，以确定它们在体外相互作用的性质。CCK-8测定结果表明，不同农药对细胞存活率的影响存在较大差异，其中苯醚甲环唑具有最强的增殖抑制毒性。Zhuang等研究结果同样证明苯醚甲环唑可以剂量依赖的方式强烈地影响HepG2细胞的存活率[33]。苯醚甲环唑是一种广谱性的三唑类杀菌剂，广泛应用于各种农作物[34]，但其在食品、水果和农田土壤中已广泛检出，可能造成的潜在风险引起公众日益关注[35-36]。Pan等研究发现，苯醚甲环唑可以下调HepG2细胞中CYP3A4酶的mRNA表达水平，并且以剂量依赖的方式抑制酶的活性[37]。此外，苯醚甲环唑还可以显著激活HepG2细胞中的凋亡相关蛋白caspase-8和caspase-9，并以剂量依赖的方式裂解DNA修复酶，同时对线粒体和内质网造成损伤[33]。因此，苯醚甲环唑作为一种重要的毒性化合物，其毒性作用的分子机制值得深入探究。

为探究农药混合物的细胞毒性，本研究进行了等效应联合暴露试验。结果显示：随着农药浓度增大，二元、三元农药组合对细胞增殖毒性作用增强。已有研究表明，混合物联合毒性可以通过单个组分的毒性效应进行预测评估。CA模型适用于具有相似作用模式的混合物体系，而IA模型则适用于具有相异作用模式的混合物体系[38]。近年来，CI指数法在环境中混合污染物风险评估方面得到了广泛应用。Chen等应用这3类模型研究了丁草胺、莠去津和氯氰菊酯对蚯蚓Eisenia fetida的联合毒性，发现CI法可以更准确地预测联合毒性[39]。本研究也得到相同结果，表明CI模型可以作为生态毒理风险评估的有用工具。本研究基于CI指数分析发现，除烯酰吗啉 + 苯醚甲环唑 + 氯氰菊酯和烯酰吗啉 + 氯氰菊酯 + 啶虫脒两个三元组合外，其他农药组合随农药剂量增大联合效应具有拮抗转为协同的趋势。烯酰吗啉 + 苯醚甲环唑 + 氯氰菊酯在5%～60%毒性效应下CI值为0.47～0.98，表明其联合效应由协同作用逐渐转为相加作用[40]。Tóth等评估了多种除草剂混合物对Aliivibrio fischeri的急性毒性，发现在EC50值浓度下，各农药组合的CI值为0.12～0.77，说明待测混合物在急性毒性试验中都产生协同的联合作用，且作用强度从强到弱[41]。DRI值表示单独与联合暴露以达到相同毒性水平时所需农药浓度的比值，可量化混合农药之间的协同作用。本研究发现，低毒性水平下三元组合烯酰吗啉 + 苯醚甲环唑 + 氯氰菊酯和烯酰吗啉 + 氯氰菊酯 + 啶虫脒协同效应产生中氯氰菊酯发挥了较大作用。Alassane-Kpembi 等基于DRI值量化真菌毒素脱氧雪腐镰刀菌烯醇、雪腐镰刀菌醇、镰刀菌烯酮-X混合物对肠道上皮细胞的协同效应，结果表明：10%毒性效应水平下所有二元组合的剂量减少指数均高于30%毒性效应水平的，说明低毒性效应下二元组合协同作用更强；通过对三元组合中各组分在低毒性效应下的DRI值进行分析，发现镰刀菌烯酮-X在混合物联合效应中毒性较弱[30]。因此，DRI值有助于量化农药单剂在混合物协同作用产生中的作用，对农药联合毒性评价具有重要意义。

联合作用的概念最早由Bliss提出，后经Hewlett等补充研究。根据混合物中不同组分的作用靶点和作用机制，联合作用主要包括相加作用、独立作用和相互作用。区别在于：当各组分作用靶点相同且作用机制相似时发生相加作用；各组分作用靶点和作用机制均不同时发生独立作用；当各组分作用靶点相同且作用机制会互相影响时会发生相互作用，从而产生更强 (协同) 或更弱 (拮抗) 的毒性[42-43]。因此确定混合体系中各农药的作用靶点有助于更准确地判定农药混合物的联合效应。

细胞凋亡最初由Kerr于1972年提出，是多细胞生物程序性细胞死亡的一种形式，其中涉及多个基因的复杂调控[44-45]。细胞凋亡在维持机体稳态以及神经系统的发展中发挥着重要作用。一些证据表明，凋亡细胞的死亡可能导致各种病理问题和神经退行性病变，如脑缺血、阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症等[46]。因此，识别一些可能导致细胞凋亡的环境化合物至关重要。本研究中，对具有协同效应的两个三元农药混合物及相关单剂对细胞凋亡的诱导作用进行分析，结果表明各处理组均以剂量依赖的方式强烈地诱导细胞凋亡。Li等同样发现，氨基甲酸酯类农药会以时间和剂量依赖的方式诱导人T淋巴细胞和自然杀伤细胞凋亡[47-48]。据报道，Annexin-V染色可以根据细胞膜的改变在早期检测细胞凋亡，常与PI联合使用，利用成像流式细胞仪测定药物对细胞凋亡的影响[49-50]。本研究采用高内涵筛选系统检测能更直观地观察细胞状态，适合高通量、多指标检测，具有操作优势[51]。细胞凋亡主要分为线粒体通路、死亡受体通路和内质网通路，这3条路径相互关联，一个通路上的某些因子可能会影响另一个通路[52]。包凌玲研究发现，苯醚甲环唑可以通过线粒体途径和内质网应激途径共同诱导HepG2细胞调亡[53]；Huang等探究了氯氰菊酯对巨噬细胞的毒性作用，结果表明，氯氰菊酯以剂量依赖的方式通过JNK/ERK途径诱导巨噬细胞周期阻滞和凋亡而导致免疫细胞死亡[54]。目前对混合农药的凋亡通路研究较少。本研究发现，在0.25 × EC50～EC50值浓度范围内，相比于农药单剂，三元组合烯酰吗啉 + 氯氰菊酯 + 啶虫脒可显著诱导细胞凋亡，表现出协同效应，这与CI模型预测结果相同，证明该模型的可靠性。同样地，Jia等发现，与单独使用硫丹和代森锌相比，暴露于混合物会增强细胞凋亡水平[55]。因此探究混合农药的凋亡毒性及机制对污染物风险评估具有重要意义。

综上所述，各农药单剂和组合可以抑制HepG2细胞增殖，显著诱导HepG2细胞产生凋亡作用，但是混合农药诱导凋亡的作用机制尚不清楚，需要进一步通过细胞体外实验和动物体内实验探究其凋亡靶点和通路，为评估农药多残留联合毒性机制提供科学依据。