血塞通联合丙泊酚治疗创伤性脑损伤疗效及作用机制研究

王琼仙，吴春妍，王利梅，李进涛，张兰春，郑红，曹雪，杨骐睿，李成，吴林雄△

（1 昆明医科大学实验动物学部，云南 昆明；2 昆明医科大学公卫学院，云南 昆明；3 昆明医科大学药学院；云南 昆明)

0 引言

血塞通的主要有效成分是三七总皂苷[1]。功能主治是活血祛瘀，通脉活络，抑制血小板聚集和增加脑血流量，具有止血、镇痛、散瘀、活血消肿等作用。丙泊酚化学名为2,6-双异丙基苯酚，是目前临床上普遍用于麻醉诱导、麻醉维持、ICU 危重病人镇静的一种新型快速、短效静脉麻醉药[2]。本项目是在复习大量文献基础上拟调查血塞通联合丙泊酚对脑的治疗效果，是否是通过上调BDNF 及其受体TrkB 和下游信号分子来实现的。

1 材料与方法

1.1 动物的分组

140只成年SD 大鼠，雌雄各半，体重（200±20）g，随机分为四组。正常组（假手术组 A 组），TBI+脂肪乳组（脑损伤组 B 组），TBI+丙泊酚组（丙泊酚治疗脑损伤组 C 组），TBI+丙泊酚+血塞通组（血塞通联合丙泊酚治疗脑损伤组 D 组）。实验动物购于昆明医科大学实验动物学部，实验动物质量合格证号：SYSK(滇)2005-0004，许可证号SCXK(滇)2011-0004。

1.2 动物模型建立与药物治疗

采用改良的Feeney 氏法自由落体撞击制作脑外伤模型[3]。用3.6%水合氯醛(1ml/100g)进行腹腔注射麻醉。麻醉完全后,将大鼠俯卧位固定，常规消毒铺巾,在头距前囟5mm 处冠状切开皮肤成“V”或“U”型切口, 将头皮向尾侧翻开。分离骨膜,暴露右侧顶骨,于矢状缝旁开2.5mm,冠状缝后1.5mm 钻一骨孔,咬除颅骨直至骨窗扩大为直径5.0mm×5.0mm,显露硬脑膜，注意保护矢状窦和硬脑膜。将洁净的垫片轻轻地置于骨窗中央，以50g 重的铁质圆柱体自30cm 高处沿铁杆自由落体撞击垫片,造成右侧大脑运动皮质区挫裂伤。假手术仅咬除颅骨，不进行砸伤，饲养护理同手术组。术后前3型每日给脑外伤大鼠腹腔注射头孢8万单位预防感染，术后2 周内每日早晨8点给予药物治疗，剂量及给药方式如下：丙泊酚20mg/kg，腹腔注射。血塞通50mg/kg。

1.3 行为学评价

1.3.1 大鼠的神经功能缺损评分（neurological severity score，NSS）

分别于损伤后1d、3d 和7d 进行神经功能双盲法评分，三个经过培训熟练掌握评分标准的人进行评分，取平均值进行统计学评分，每天评分时间固定在早上8：00。

1.3.2 电生理CSEP 皮层体感诱发电位检测

将大鼠头部固定于脑立体定位仪平台,剪去颅顶毛,在前囱部位沿中线切开皮肤1.5cm,钝性分离,充分暴露颅骨,清楚地暴露颅骨骨缝,在冠状缝后缘1-2mm、矢状缝旁开2-3mm,手持电钻,用2.5mm 球形牙科钻缓缓钻磨颅骨,要求恰好钻到出现白色的、略带透明的骨皮质,然后用眼科镊,轻轻挑起残余的骨皮质,并小心剥离,即可暴露出完好的硬脑膜[4]。然后将银球引导电极用万向夹固定于钻孔处,相当于皮层感觉运动区(额顶区)，随后将2个注射针头分别插入大鼠对侧前爪腕部的两侧皮肤,刺激输出的2个电极(注意2个电极不能相触)，分别连接2个注射针头,开始刺激并观察诱发电位的变化。

1.4 样本获取

NSS 评分及电生理检测结束后，开始灌注固定取材，用于形态学研究；每组15只。材料放入4%多甲固定过夜，其它动物模型，分别治疗后3d、7d，进行新鲜样本取材；首先每个时间点10只/组，获得脑组织，入-80℃冰箱备用。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 NSS 评分

NSS 评分结果见图1。

图1 各组间所得神经损伤程度评分

血塞通联合丙泊酚治疗脑外伤中TrKB mRNA 的表达变化：

与3d 时相比，TrKB mRNA 的表达水平在血塞通和丙泊酚联合治疗7d 后明显降低（P≈0.00＜0.01）。术后1d，脂肪乳组的TrKB mRNA 的表达明显降低（P≈0.00＜0.01），给予丙泊酚处理后，又显著逆转了这一降低（P≈0.00＜0.01）；同样的损伤后3dTrKB mRNA 的表达水平也被明显降低（P≈0.00＜0.01），给予丙泊酚处理后其表达较TBI+fat 组明显进一步降低（P=0.0008＜0.01），然而在血塞通联合丙泊酚治疗组中TrKB mRNA 的表达水平明显又高于TBI+pro 组（P≈0.00＜0.01）；在术后7d 时，损伤组的TrKB mRNA 的表达量明显高于Sham 组，各组间的变化趋势大体与术后3d 相同，损伤后TrKB mRNA 的表达较Sham 组明显升高（P=0.00000006＜0.01），而丙泊酚治疗后则显著低于TBI+fat 组的（P≈0.00＜0.01），同时在接受血塞通联合丙泊酚治疗后，TrKB mRNA 的表达更进一步降低（P≈0.00＜0.01）。

2.2 电生理CSEP 皮层体感诱发电位结果

血塞通+丙泊酚+TBI 治疗后与治疗前比较，潜伏期缩短，波幅降低，说明SD 大鼠脑损伤后脑部通路受到一定的损伤[5]。P=0.000 ＜0.01，有显著统计学差异。

3 讨论

本实验通过建立TBI 大鼠模型，用血塞通联合丙泊酚治疗后与治疗前比较，通过行为学评价结果显示：血塞通+丙泊酚+TBI 治疗后与治疗前比较，从NSS 评分结果我们发现单纯丙泊酚组，血塞通联合丙泊酚组对TBI 损伤都有治疗作用，但通过比较发现联合用药组展现出更好的治疗效果；而从CSEP 电生理检测结果我们可以看出TBI 损伤后的确对大鼠的神经传导功能造成了抑制性的作用[6,7]，经过治疗后发现联合用药组能够让神经传导功能有一个更好的恢复作用。同时经过使用联合用药后丙泊酚TBI组应有的炎症细胞因子合成释放被抑制的现象消失了，出现了降低后的一个BDNF 升高表达的上调，从而影响其受体TrkB 升高而上调[8,9]。

综上所述，本课题血塞通治疗TBI 的过程中，对丙泊酚的抗损伤作用，是通过上调BDNF 及其受体TrkB 来实现的，加入血塞通治疗TrKB 明显升高，证明血塞通治疗TBI 不仅上调了BDNF，同时也上调了它的受体TrKB,只有两者同时上调，才能完美结合，发挥BDNF 的生物学神经营养的作用[10-12]。