利福昔明对幽门螺杆菌的体外抑菌作用研究

刘 谦，姚 倩，王万聪，王文真，夏兴洲，郑 权，郑鹏远

郑州大学第五附属医院消化内科，河南 郑州 450052

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，H.pylori)是一种定植于人体胃黏膜组织中的革兰氏阴性微需氧菌，在正常人群中感染率极高，并且具有较强的传染性，感染后不经过治疗难以自愈。2017年《第五次全国幽门螺杆菌感染处理共识报告》中推荐了使用质子泵抑制剂(PPI)+两种抗生素+铋剂的四联用药方案[1]。利福昔明属于利福霉素衍生物，难以被胃肠道吸收，抗菌活性较广泛，抗菌谱覆盖了大多数革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，包括需氧菌和厌氧菌，不良反应轻微[2]。临床上多用于治疗急性或慢性肠道感染、小肠结肠炎、腹泻综合征等疾病[3]。但利福昔明对于H.pylori是否有抑菌作用却鲜有报道。本实验为利福昔明对H.pylori体外抑菌实验，采用纸片琼脂扩散法和琼脂稀释法探讨利福昔明对H.pylori的体外抑菌作用和最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 研究对象选取2019年4月至2019年12月在郑州大学第五附属医院行13C-快速尿素酶呼气试验检查(13C-UBT)且结果为H.pylori阳性的门诊及住院患者为研究对象，男127例，女121例，年龄18～69岁。纳入标准：(1)年龄不限，男女不限；(2)有消化道症状，如腹痛、腹胀、反酸、嗳气、恶心等；(3)无消化道急症，如胃肠穿孔、急性胆胰系统急症、急性消化道出血等；(4)近1个月内未使用对H.pylori有杀灭作用的抗菌药物、铋剂、H2受体拮抗剂及PPI；(5)未行胃大部切除术，胃结构完整；(6)同意钳取胃黏膜组织进行H.pylori培养及药敏试验。在胃镜下取胃黏膜组织样本进行H.pylori的分离培养。

1.2 研究材料

1.2.1 材料：培养基(哥伦比亚血琼脂培养基，均购自郑州安图生物工程股份有限公司(产品批号:201903224B),利福昔明药敏纸片、利福昔明药片均购自北京天坛药物生物技术开发公司。

1.2.2 主要仪器：恒温培养箱(日本Sanyo公司，型号MIR-254-PC)，生物安全柜(海尔HR900 B2级)，4 ℃冰箱(日本Sanyo公司，型号MDF-U333)。

1.3 方法

1.3.1 胃组织采集：患者进行常规胃镜检查，采集胃角胃黏膜及胃幽门前区活组织。用无菌镊子将所采集组织转移至血平板上，用接种环均匀涂抹于血平板上，置入三气培养箱内进行微需氧培养，条件为：温度37 ℃、O25%、CO210%、N285%，培养2～3 d。

1.3.2H.pylori菌株鉴定：满足下列条件的菌株鉴定为H.pylori：(1)菌落特征：无色透明、针尖样细小或融合成片，菌落表面光滑。(2)革兰染色结果：阴性，光镜下可表现为多种形态，如圆形、弧形、海鸥状弯曲或短杆状。(3)生化反应结果：尿素酶试验阳性、触酶试验阳性和氧化酶试验阳性。

1.3.3 药物敏感试验(纸片琼脂扩散法)：用接种环挑取菌落，在药敏培养基上按不同方向涂布3次，每次转动60°，最后沿着平板边缘扫划1圈。用无菌镊子将药敏纸片放入培养基表面，使纸片与培养基表面完全贴合。将平板放入三气培养箱进行微需氧培养，培养2～3 d，测量抑菌圈的直径。

1.3.4MIC测定：采用琼脂稀释法，将不同浓度的抗菌剂混合溶解在琼脂培养基中，用接种环挑取菌落，在药敏培养基上按不同方向涂布3次，每次转动60°，最后沿着平板边缘扫划1圈。接种密度要求培养后在平板上形成完全融合的均匀菌苔生长。置于微需氧环境中培养2～3 d，观察有无菌落生长，无菌落生长的最低药物浓度为MIC。

2 结果

2.1H.pylori的鉴定在显微镜下挑选可疑菌落(无色透明针尖样菌落，扁平或呈圆形)(见图1)。经尿素酶检测后变红，氧化酶检测后变深紫色，鉴定为H.pylori。本次试验共采集患者胃组织248例，成功培养鉴定为H.pylori共154例。

图1 培养出的H.pylori菌落Fig 1 H.pylori colonies cultured

2.2 药物敏感试验(纸片琼脂扩散法)在154例培养出的H.pylori中，9例抑菌圈的直径为0，45例抑菌圈的直径为1～10 mm，76例抑菌圈的直径为11～20 mm，24例抑菌圈的直径为>20 mm。

2.3MIC测定(琼脂稀释法)按美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)标准判读结果[4]。利福昔明对所培养出的154例H.pylori菌(株)MIC为0.004～0.38 mg/ml，MIC50为0.094 mg/ml，MIC90为0.25 mg/ml。

3 讨论

H.pylori是人类常见致病菌之一。据人群流行病学调查显示，我国H.pylori感染率非常高，为40%～90%，平均59%[5]。已证实，H.pylori感染与多种胃肠道疾病密切相关，约半数患者会发生胃黏膜萎缩，10%～15%的H.pylori感染者可发展为消化性溃疡(主要为十二指肠球部溃疡)，少数(2%～3%)可发展为胃恶性肿瘤(胃癌、胃MALT淋巴瘤)。此外，H.pylori感染也会引起一系列的胃肠外疾病的发生，如不明原因的缺铁性贫血、特发性血小板减少性紫癜等[6-7]。在H.pylori根除治疗方案中，PPI+两种抗生素+铋剂的四联疗法是共识建议且有效的根除H.pylori的一线治疗方法[8]，但抗生素的长期广泛使用将导致耐药现象的出现。而且大量抗生素的同时应用会导致胃肠道菌群失衡、微环境失衡，出现腹胀、腹泻、便秘、抗生素相关性肠炎等不良反应，因此，寻找其他药物来替代常用抗生素对于H.pylori的根除治疗已刻不容缓。

利福昔明抗菌谱较广，抗菌活性较强，对多种革兰氏阳性、革兰氏阴性菌均有较强的抗菌作用。动物实验和临床研究发现，利福昔明口服不吸收，其通过杀灭肠道的病原体在局部发挥抗菌作用，且它与其他药物几乎无相互作用，耐受性良好，不易引起全身性不良反应[9]，在治疗肠易激综合征(IBS)、急性肠道感染、炎症性肠病(IBD)、肝性脑病等常见消化系统疾病中显示出一定的疗效[10-13]。

本研究结果表明，利福昔明对H.pylori菌株具有体外抑菌作用，其MIC为0.004～0.38 mg/ml，利福昔明的常用剂量为0.8 g/d，口服后，在胃内浓度将高于其对H.pylori的MIC0.38 mg/ml，因此，将其作为抗H.pylori治疗的药物，有望提高H.pylori的根除率，其不良反应轻微，患者依从性更高。但利福昔明对H.pylori感染的作用机制仍不清楚，需要进行进一步的研究。