HO-1在不同病因肝硬化中的研究

孟 蝶，杨 慧，张晓倩，张晓华

山西医科大学第一医院感染病科，山西 太原 030001

肝硬化是一种由病毒性肝炎、酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝病、自身免疫性肝病(autoimmune liver disease,AILD)等多种病因引起的终末期肝病，以门脉高压和肝功能减退为特征性临床表现，失代偿期肝硬化5年病死率为70%～86%。肝硬化的发生发展机制十分复杂，是多因素共同作用的结果，炎症与氧化应激在其中有重要作用且直接与疾病进展相关[1]。在氧化应激作用下发生的肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)活化是肝纤维化发生发展的核心环节[2]，为进一步向肝硬化发展提供了基础。血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)是一种氧化应激反应蛋白，将具有强氧化作用的血红素分解为一氧化碳、胆红素、铁，近年来这种酶促反应的生物学效应受到广泛关注。HO-1及其代谢产物可通过抗炎、抗氧化、调控凋亡等发挥细胞保护作用进而抑制肝硬化进展。不同原因的肝硬化发生机制不同，HO-1对于其保护作用的作用机理也有所差异，如何运用不同作用机理调控HO-1表达抑制肝硬化进展值得进一步深入探讨，本文对近年来HO-1在不同病因肝硬化中的研究作一概述。

1 HO-1概述及其在肝硬化中的作用

HO-1又称热休克蛋白32(heat shock protein 32，HSP32)，其基因定位于人染色体22q12，分子量为32 KDa，是广泛存在于哺乳动物中的可诱导酶，可经缺氧、缺血再灌注、内毒素、炎症因子等多种因素诱导表达并产生保护作用。HO最早由Tenhunen等[3]于1968年发现存在于细胞微粒体中且他们同时发现HO-1在肝脾中活性最强。在正常的肝脏，HO-1主要存在于Kupffer细胞中，而在各种原因诱导的肝纤维化及肝硬化中，HO-1在HSC、Kupffer细胞及肝窦内皮细胞中均有表达，广泛参与了许多疾病的病理生理过程。

肝硬化患者血清中HO-1的表达水平明显高于健康对照组，且主要分布于肝脏的门管区周围及脾脏的红髓区[4]。HO-1的表达及其催化血红素的代谢产物可通过多种作用机制及通路在肝硬化及其各种并发症中发挥保护作用。Wang等[5]使用Znpp抑制HO-1表达后发现，HO-1表达降低可通过Nrf2/Keap-1通路减少大鼠肝脏内铁沉积及一氧化碳释放，从而抑制肝硬化进展。此外，本课题组前期研究结果显示，HO-1可通过调节PPAR/NF-κB信号通路及其下游炎症因子的释放抑制HSC的活化及细胞外基质的产生而发挥抗纤维化作用[6]。因此，肝硬化患者血清HO-1水平的升高可能是机体自我保护机制的体现。但HO-1对肝硬化的保护作用存在一个阈值，肝硬化早期低水平HO-1诱导表现出保护作用，而在肝硬化晚期门脉高压阶段，HO-1过度表达则加重肝细胞损伤，促进门脉高压高血流动力循环改变，加重肝硬化[7]。HO-1还参与了包括肝性脑病、肝肾综合征等在内的多种肝硬化晚期并发症的形成，但其在各器官中的表达不尽相同。

2 HO-1与病毒性肝炎肝硬化

随着人们生活习惯的改变，肝硬化的病因谱也在发生着变化，但最新的研究结果显示，病毒性肝炎仍为我国目前导致肝硬化的首要原因[8]，每年约33万人死于HBV或HCV感染导致的肝硬化及相关并发症[9]。HO-1在病毒性肝炎肝硬化患者中的表达上调且其对于病毒性肝炎肝硬化的保护作用主要是通过其抗病毒作用来实现的。

HO-1具有直接抗HBV作用，且以时间和剂量依赖的方式抑制病毒复制，其抗HBV机制是通过影响HBV核心蛋白的稳定性，阻断HBV cccDNA转录后的各环节引起病毒载量的降低[10]。HO-1还可通过调节机体免疫应答发挥抗HBV作用。有学者对乙肝肝硬化患者HO-1基因各等位基因及基因型进行分析，结果显示，rs2071746位点及rs2071749位点AG单倍型可能是乙肝肝硬化患病的危险因素，但可因性别、民族、年龄、BMI、吸烟情况等不同而产生差异[11]，该研究结论或可为乙肝肝硬化的诊治在基因水平提供新思路。

同样HO-1可通过直接抗HCV抑制丙肝肝硬化的进展，且HO-1对HCV的抑制作用强度与宿主基因多态性有关。miR-196及miR-let-7c等可靶向调控Bach1的表达进一步诱导HO-1高表达直接抑制HCV的复制[12]。HO-1催化血红素的代谢产物也可发挥抗HCV作用，其中胆红素占首要地位，胆红素可直接抑制HCV-NS3/4a蛋白酶的活性从而发挥抗HCV作用，也可通过增强具有抗病毒功能的干扰素α2和α17的表达而减少HCV复制。铁的抗HCV作用主要是由于铁对HCV RNA聚合酶的二价结合位点具有很强的亲和力，对HCV RNA聚合酶的NS5B具有抑制作用[13-14]。

3 HO-1与酒精性肝病肝硬化

酒精性肝病是长期大量饮酒引起的慢性肝病，呈进行性发展，酒精性肝病肝硬化占各种原因所致肝硬化的24.0%以上，已成为导致肝硬化的第二大病因[15]。长期大量饮酒是酒精性肝病肝硬化的起始因素，长期暴露于大量乙醇中，细胞色素P4502E1(CYP2E1)表达活跃可催化乙醇转化为乙醛，同时大量生成活性氧(ROS)，诱导氧化应激反应进而促进肝硬化的进展，因此CYP2E1的诱导被认为是酒精所致氧化应激的中枢途径。Lu等[16]研究发现，CYP2E1基因敲除的小鼠较野生型小鼠ROS的产生相对较少，肝硬化的程度也更轻，这也提示CYP2E1基因参与了酒精性肝病肝硬化的发生发展。Cong等[17]研究发现，转染CYP2E1后的HepG2细胞产生的氧化毒性可被HO-1的升高所抑制，同样证明了HO-1在CYP2E1引起的氧化应激反应中起关键作用。HO-1催化的血红素裂解反应可直接抑制CYP2E1的合成进而减弱乙醇诱导的ROS形成脂质过氧化，而HO-1催化血红素裂解的产物CO可通过降低CYP2E1的酶活性间接抑制ROS的形成从而发挥对肝硬化的保护作用。

酒精性肝病肝硬化除氧化应激外，主要表现为炎症反应，乙醇及其代谢产物可诱导TNF-α及IL等促炎细胞因子的释放，这些细胞因子的释放会活化中性粒细胞、淋巴细胞等免疫细胞进一步激活HSC产生大量胶原纤维，形成肝硬化。Xu等[18]通过慢性加单次暴饮乙醇喂养小鼠最佳模拟人体酒精性肝病的发病过程，证实了紫杉醇诱导HO-1高表达对酒精性肝病所致肝损伤及肝硬化具有重要作用，其保护作用可能与抑制CYP2E1活性及炎症因子TNF-α、IL-6等的分泌有关。以上结果表明，HO-1可作为酒精性肝病肝硬化疾病预测的重要方面。此外，最新研究发现,运动可上调Nrf2/Keap-1/HO-1通路的表达进一步保护肝脏免受乙醇所致的氧化损伤[19]，且临床中应用的槲皮素、姜黄素、银杏黄酮等对酒精性肝病的保护作用也是通过调控HO-1的表达来实现的。

4 HO-1与非酒精性脂肪性肝病肝硬化

随着人类生活方式及饮食习惯的改变，非酒精性脂肪性肝病的发病率逐步上升，非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)患者10～15年内肝硬化发生率为15%～25%[15]。非酒精性脂肪性肝病必须经过NASH这一过渡阶段才能进展为肝硬化，在NASH患者肝组织内异常增加的脂质、游离脂肪酸通过增强脂质过氧化及氧化应激反应激活Kupffer细胞释放炎症介质，可加速HSC激活、转化，进一步合成大量细胞外基质并促进血管生成相关基因表达，从而导致肝硬化。

血浆HO-1水平与NASH相关肝脏疾病发展密切相关，可能成为诊断NASH相关疾病的灵敏标志物，且与血清白细胞计数联合诊断灵敏度更高。miRNA参与NASH相关肝硬化的发生与发展，血晶素诱导HO-1高表达能够抑制Wnt信号通路进而影响肝硬化进程[20]。有学者通过建立非酒精性脂肪性肝纤维化模型，用血晶素、锌原卟啉进行干预实验，以明确HO-1基因调控阻止该病发生发展的分子机制，结果显示，诱导HO-1高表达可通过增加SOD的表达与活性及调节IκK/IκB/NF-κB通路等两方面抑制NF-κB基因的活化，NF-κB基因表达降低可减少ICAM-1及PDGF等炎症因子及促纤维化因子的释放，从而保护肝脏免受炎症与氧化应激的影响[21]。此外，南月敏教授团队的研究结果表明，HO-1高表达可抑制HSC活化，进而下调α-SMA、HIF-1α、VEGF、iN0s、MIP-1α等血管生成相关基因的表达，阻止肝纤维化进展[22]。同时该课题组研究发现，目前备受关注的扶正化瘀方通过调节IKKβ/NF-κB和TGF-β1/Smad信号通路及HO-1等氧化应激相关因子的表达来预防NASH相关肝硬化[23]。

已有学者在非酒精性脂肪性肝病的细胞和动物模型中观察到内质网的完整性严重破坏，HO-1可减轻NASH相关肝硬化发展过程中的ROS累积，进一步减少内质网应激引起的肝细胞凋亡从而发挥保护作用。Raffaele等[24]运用TGF-β作为肝纤维化因子建立肝纤维化的体外模型，在其中发现HO-1活性抑制可使ROS水平增加及脂质过氧化产物生成导致纤维化的发生和发展，这些新发现也为NASH相关肝硬化和HO系统之间的联系提供了额外的证据。结合目前研究，我们认为HO-1在NASH相关肝硬化中起积极作用，HO-1可作为NASH相关肝硬化的血清学标志物及治疗靶点，提高早期诊断率并指导临床治疗。

5 HO-1与自身免疫性肝病肝硬化

自身免疫性肝病肝硬化多由AILD引起，以自身免疫性肝炎及原发性胆汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis，PBC)为主。近年来，AILD的发病率或检出率有所提高，已成为除病毒性肝炎外致肝硬化的又一主要原因，目前AILD发病机制尚不明确，大多数认为与遗传易感性和免疫紊乱有关。AILD发病过程中的异常免疫反应可引发自身T淋巴细胞和 B淋巴细胞等免疫细胞的激活与扩增，产生大量炎性介质，诱导氧化应激反应，促进HSC活化及胶原合成，加速肝硬化的形成[25]。

PBC患者HO-1浓度及HO-1 mRNA表达水平均明显低于对照组，提示HO-1在PBC的进展中可能发挥抗氧化应激保护作用。同时研究[5]证实,诱导HO-1高表达可延缓肝硬化疾病进展，其可直接抑制HSC活化，也可通过保护肝细胞、减轻炎性反应、抑制细胞因子的释放等间接抑制HSC的活化。Duan等[26]研究结果表明,降低或提高HO-1水平可能通过改变大鼠肝组织中TGF-β1的表达而诱导或抑制HSC的活性和增殖。高晓鹏等[27]在研究Nrf2/Keap1信号通路在PBC患者中的抗氧化应激作用时证实，HO-1作为Nrf2的下游信号分子，参与了Nrf2/Keap1信号通路在PBC患者中的抗氧化应激作用。Sass等[28]研究结果显示，诱导HO-1表达可通过抑制半胱天冬酶-3的活性保护大鼠肝脏免受抗CD95抗体、抗CD3抗体、LPS、TNF-α等的损伤，减轻肝脏的氧化应激反应及肝细胞凋亡。可见HO-1高表达在自身免疫性肝病肝硬化中已成为对抗氧化应激的一种机制，是延缓AILD向肝硬化进展的重要靶点。

6 HO-1与药物性肝损伤肝硬化

药物性肝损伤(drug-induced liver injury，DILI)是指由各类处方或非处方的化学药物、生物制剂、中药、保健品等所诱发的肝损伤，由于我国医务人员及公众对药物安全性问题的认知不够，DILI的发生率有逐年升高趋势。目前我国引起DILI的药物中，主要是治疗皮肤病及风湿病等的中药，其次是抗结核药与解热镇痛药。药物及其活性代谢产物诱导肝细胞线粒体损伤和氧化应激可通过多种分子机制引起肝细胞损伤和死亡，继而引起肝硬化的发生。

抗结核类药物以异烟肼(Isoniazid，INH)和利福平(Rifampicin，RFP)的肝脏损伤最为显著，CYP2E1作为主要的微粒体催化酶，参与了INH的氧化代谢和肝毒性中间产物的生成，在INH-RFP引起的氧化应激过程中，CYP2E1过度表达导致HO-1受到抑制，从而使HO-1失去对INH-RFP诱导的氧化应激的保护作用进而导致肝脏损伤[29]。在动物实验中发现，RFP及其活性代谢产物在细胞和动物两个层面均可增强肝细胞的氧化应激，采用Hemin诱导HO-1高表达可减轻RFP所致的氧化应激[30]。Yang等[31]对我国314例抗结核药物性肝损伤(anti-TB drug-induced liver injury，ATLI)患者的HO-1基因型进行分析，结果显示，携带rs2071748的GG基因型患者发生ATLI的风险更高，这也说明中国人群中HO-1基因多态性可能与ATLI易感性有关，因此我们可以考虑从基因水平出发更好地防治ATLI。

解热镇痛药的代表是对乙酰氨基酚(acetaminophen，APAP)，APAP的肝毒性主要是由其经CYP450代谢转化的产物NAPQI引起，NAPQI可使肝细胞氧化应激和线粒体功能失调。目前，Nrf2/HO-1信号通路已经成为APAP所致肝损伤研究领域的重点及热点。顾佳毅等[32]研究结果显示，低剂量的LPS可通过TLR预激活Nrf2/HO-1信号传导通路，减轻APAP引起的氧化应激，延缓DILI进展为肝硬化。虽然目前有大量研究表明RFP具有肝毒性，但有学者发现RFP通过AMPKα和Nrf2/HO-1途径能有效保护肝脏免受APAP引起的氧化应激[33]。综上，HO-1主要通过抑制肝脏氧化应激发挥对DILI所致肝硬化的保护作用，Nrf2/HO-1的深入研究或可为药物性肝损伤肝硬化的治疗提供新的策略。

从目前研究来看，HO-1作为人体内重要的抗氧化酶，在肝硬化患者体内明显升高并具有保护作用，其机制主要与减弱肝硬化过程中的炎症与氧化应激反应有关，我们认为HO-1可能成为肝硬化的预测因子并为肝硬化的治疗提供新思路。本课题组早期研究同样也表明，肝硬化患者血清HO-1代偿性高表达，且通过绘制ROC曲线分析发现，HO-1对肝硬化的疾病进展程度有一定的预测价值[34]。但HO-1对肝硬化的保护作用并不是无上限的，HO-1过表达可加速肝脏损伤，我们的研究结果证实Child-Pugh C级患者血清HO-1含量明显低于Child-Pugh B级患者，这也提示HO-1的抗炎、抗氧化作用在肝硬化晚期可能出现耗竭，导致肝硬化患者病情迅速进展。因此需对HO-1的具体作用机理、最适效应及不同诱导方式等进行深入研究，以便运用适当的途径调控HO-1表达延缓肝硬化疾病进展从而提高患者生活质量。我国导致肝硬化的病因主要有病毒性肝炎、酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝病、AILD等，大量研究结果显示，HO-1对不同病因肝硬化均具有保护作用，其作用机制不尽相同，本课题组比较了不同病因肝硬化患者血清中HO-1的表达，其间差异无统计学意义[34]，但HO-1对肝硬化患者的预测能力及保护作用强度是否与病因相关仍需进一步探讨，以期从不同角度针对性地进行防治。