内质网应激与肝衰竭的相关研究

胡 雪， 江应安

武汉大学人民医院感染科，湖北 武汉 430060

内质网是一种真核细胞重要细胞器，是蛋白质糖类和脂类的重要合成基地，与物质运输和交换、解毒作用密切相关。内质网应激即内质网功能的紊乱，是细胞的一种重要的自我防御机制[1]。肝衰竭是多种因素引起肝脏合成、解毒及代谢功能严重障碍的临床危急重症。目前关于内质网应激与肝衰竭的发生发展暂无系统性的认识。因此，本文就内质网应激的概念、信号通道及其与肝细胞代谢、炎症、氧化应激及在肝衰竭动物模型和临床中的最新研究结果作一概述。

1 内质网应激的概述

内质网是一种真核细胞重要细胞器，负责蛋白质合成、折叠、运输，维持钙稳态和脂类的合成和加工。在正常情况下，异常折叠或未折叠的蛋白质通过内质网相关降解过程被蛋白酶体降解。然而，在病理情况下，异常折叠或未折叠的蛋白往往在内质网内大量聚集，引起内质网功能紊乱，即形成内质网应激[1]。正常细胞有维持内质网稳态的自我保护机制，即未折叠蛋白反应(unfolded protein response，UPR)。此种反应包含三种机制：(1)减少进入内质网的蛋白质负荷，通过降低蛋白质的合成和转位来实现；(2)增加内质网处理未折叠蛋白的能力，通过UPR靶基因的转录激活；(3)细胞死亡被促发，保护机体免受出现异常折叠蛋白质细胞的伤害[2]。然而，发生严重的或持续的内质网应激时，可触发线粒体凋亡过程以消除受损细胞。

2 内质网应激信号通道

内质网膜上有三种应激传感器：激活转录因子6(activating transcription factor 6，ATF6)、蛋白激酶R样内质网激酶(protein kinase R-like ER kinase，PERK)、肌醇需求因子1(inositol-requiring enzyme 1，IRE1)。这三个应激传感器受伴侣分子葡萄糖调节蛋白78(GRP78/BiP)调节，在未激活状态下，此调节因子结合到三种应激传感器，从而抑制它们的信号激活。当内质网应激促发时，GRP78与这三种应激效应器分离，解离后的应激效应器三个分子分别激活相关信号传导通路，启动UPR[3]。ATF6是一种内质网膜上的Ⅱ型跨膜蛋白，N末端的结构域上含有bZIP转录因子。发生内质网应激时，ATF6移位至高尔基体，并被蛋白酶S1P和S2P裂解，从而释放其胞质结构域(ATF6f)。ATF6f可调控UPR相关基因的上调[4]。PERK是一种内质网膜上的Ⅰ型跨膜蛋白。发生内质网应激时，PERK与GRP78解离后，通过自身磷酸化激活，激活的PERK调控下游的真核翻译起始因子2α(eukaryotic translation initiation factor 2α，eIF2α)发生磷酸化，导致蛋白质合成暂时减少，使细胞有时间重新折叠或降解内质网中未折叠的蛋白质[5]。IRE1是一种具有蛋白激酶和核糖核酸内切酶活性的跨膜蛋白。当发生内质网应激时，IRE1 发生二聚化和自身磷酸化而被激活，激活的IRE1通过其核酸内切酶活性剪切X 盒结合蛋白(X-box binding protein-1，XBP1)mRNA中的26碱基内含子，剪切后的XBP1s移位到细胞核介导内质网相关降解反应(ERAD)，促进内质网膜膨胀，缓解内质网应激[6]。

3 内质网应激与肝细胞代谢

肝细胞富含内质网，内质网膜占总细胞膜的50%。肝细胞是重要的分泌细胞，能合成和分泌除免疫球蛋白的大多数血浆蛋白，且大多数分泌蛋白和定位质膜的蛋白需要在内质网进行正确折叠。内质网也是多种脂类合成的场所，包括胆固醇、神经酰胺和磷脂。肝细胞的滑面内质网还具有亲脂性药物和外源性解毒机制[7]。因此，内质网在肝细胞的生理功能中起重要作用。虽然肝细胞含大量的内质网，但肝细胞对内质网功能的破坏很敏感。内质网伴侣蛋白GRP78是内质网稳态和应激反应的调节因子，研究发现，小鼠肝特异性GRP78丢失可导致肝脂肪变性、自发肝损伤和肝细胞凋亡，而且小鼠对酒精、高脂肪饮食、药物和毒素引起的各种肝脏疾病敏感[8]。类似的，参与内质网转位子组分Sec61a1功能缺失可引起肝脂肪变性和肝肿大，并激活内质网应激反应[9]。最近的几项研究提高了关于单个UPR传感器对肝脏生理功能的认识。小鼠肝脏XBP1特异性敲除表现出严重的低胆固醇血症和低甘油三酯血症，原因是脂肪酸的新合成减少[10]。小鼠肝脏特异性敲除ATF6加重高糖饮食诱导的肝脂肪变性和糖耐量异常[11]。这些研究表明内质网应激相关分子参与调控正常肝细胞代谢过程。

4 内质网应激与炎症

内质网应激可参与炎症反应过程，并且内质网应激和炎症可相互调节，即内质网应激可以直接启动炎症通路,而且炎性刺激如活性氧(ROS)和细胞因子也可以触发内质网应激[12]。内质网应激与几种炎症反应途径相关，包括NF-κB、AP-1、JNK等。NF-κB是炎症反应的主要调控分子，正常状态下，NF-κB在胞质中与IκB激酶(IKK)复合物的结合被抑制。当炎症刺激时，IKK复合物发生磷酸化而降解IκB蛋白，从而使NF-κB二聚体转移至细胞核，诱导多种细胞因子和趋化因子的表达。IRE1α通过结合肿瘤坏死因子(TNF)受体2相关的因子(TRAF2)，从而招募IKK复合物，引起NF-κB通路的激活[13]。siRNA下调ATF6可通过抑制NF-κB和调控Akt激活，从而缓解内质网应激介导的巨噬细胞炎症反应[14]。磷酸化eIF2α可通过降低IκB蛋白的翻译水平而激活NF-κB通路[15]。AP-1 是由不同家族的转录因子组成的二聚体，如JUN、FOS、ATF和MAF。AP-1可通过上调细胞因子、趋化因子和其他促炎分子的水平来调节炎症。研究报道RAW264.7巨噬细胞内质网应激可促进AP-1激活[16]。此外，内质网应激可激活MAPK通路调控炎症反应，主要包括JNK和p38通道。磷酸化的IRE1可通过募集TRAF2和ASK1直接激活JNK。在IRE1持续激活的条件下，低XBP1信号和JNK的持续激活能促进组织炎症、炎症细胞因子和趋化因子的产生。相反，MAPKs也可以调节内质网应激相关蛋白的表达。p38的激活可增强XBP1的入核，增强了内质网应激通路和炎症信号通路之间的密切联系[17]。除了通过调控相关转录因子调控炎症反应，内质网应激时也通过XBP1s和ATF4分子直接促发炎症反应。这些转录因子刺激炎症细胞因子的表达，如TNF、IL-6、CXCL2和CXCL3。ATF4也被证明有助于脂多糖(LPS)诱导的促炎因子CCL2在内皮细胞和视网膜的表达，以及IL-6在巨噬细胞中的表达[18]。因此，内质网应激可促进炎症反应过程。

5 内质网应激与氧化应激

氧化应激是指细胞受到损伤时，抗氧化系统和氧化系统不平衡引起的细胞反应，常常表现出来ROS大量聚集。在正常情况下，内质网中的蛋白质折叠是一个多步骤的关键过程，二硫键的形成需要氧化折叠环境。在异常状态下，机体识别一个有缺陷的二硫键，谷胱甘肽(GSH)减少二硫键的形成，导致还原性谷胱甘肽/氧化性谷胱甘肽(GSSH)的比值降低。增加内质网蛋白折叠负荷，增加细胞ROS含量，引起ROS积累。折叠蛋白引入二硫键主要需要内质网氧化还原素1(ERO1)。ERO1突变体的过表达可诱导严重的氧化应激和UPR。此外，UPR的激活可诱导ERO1的激活，导致氧化应激的增加和UPR的持续，而抗氧化剂的作用可减弱UPR，以及减少下游蛋白的分泌[19]。内质网应激与氧化应激关系密切，不仅内质网应激可以促进氧化应激反应，ROS也可加重内质网应激。外源性H2O2或有机氧化剂，如甲萘醌或二酰胺，可导致eIF2α的磷酸化，诱导ATF4表达和内质网应激反应。PERK/eIF2α的小分子和ATF4的下游靶点包括抗氧化相关基因，而且PERK的激活还导致抗氧化转录因子Nrf2从抑制剂Keap1中解离，增加细胞内GSH水平。因此，在内质网应激中，介导应激反应的eIF2α通路参与晚期氧化应激反应，但它也被用于诱导抗氧化基因，以应对外源性来源的氧化攻击[20]。这些研究表明，内质网应激与氧化应激密切相关，内质网应激可促进氧化应激，而且氧化应激也可加重内质网应激。

6 内质网应激与肝衰竭动物模型的研究

肝衰竭是多种因素引起肝脏合成、解毒与代谢功能严重障碍的临床危急重症。关于肝衰竭的发病机制，目前多数学者支持“两次打击”学说，一是由病毒直接或间接(免疫反应)所致原发性损伤，二是以内毒素-细胞因子轴-肝损伤学说为核心的继发性损伤[21]。因此，有效地控制内毒素血症及内毒素引起的肝细胞损伤是肝衰竭内科综合治疗中的重点。内质网应激可在各种肝脏损伤模型中观察到，包括酒精性肝病、非酒精性脂肪肝、缺血-再灌注损伤和胆汁淤积性肝病[22]。虽然目前关于内质网应激在肝衰竭过程中的动物研究有限，但有不少研究支持内质网应激加重肝衰竭的进展。多种急性肝衰竭动物模型证明有内质网应激相关蛋白的表达上调。N-乙酰氨基酚(APAP)诱导的药物性急性肝衰竭小鼠中，肝脏磷酸化eIF2α和ATF6明显增加[23]。LPS联合D-氨基半乳糖(D-GalN)诱导的小鼠肝衰竭模型，内质网应激相关蛋白GRP78和CHOP明显上调[24]。类似的，LPS联合D-GalN诱导的大鼠肝衰竭模型，肝组织中内质网应激相关蛋白GRP78、p-eIF2α、ATF4和CHOP明显升高，而且内质网应激抑制剂4-苯基丁酸(4-PBA)可缓解肝组织损伤[25]。四氯化碳(CCl4)诱导的小鼠肝衰竭研究发现，肝组织磷酸化eIF2α明显增加，用内质网应激抑制剂4-PBA可明显抑制小鼠肝损伤[26]。有研究证明，CHOP基因敲除小鼠对APAP诱导的肝损伤有保护作用，能减少肝坏死，提高小鼠存活率[27]。此外，有研究发现，内质网应激抑制剂(TUDCA)可抑制APAP诱导内质网应激标志物CHOP、XBP1、p-eIF2α的上调，并且减轻肝组织的炎症损伤，缓解血清转氨酶上调[28]。由此可见，各种肝衰竭动物模型中，内质网应激相关分子均明显上调，而且内质网应激抑制剂可缓解肝损伤。因此，内质网应激可能参与调控肝衰竭过程中的病理损伤。内质网应激相关分子可作为肝衰竭的新靶点。开发靶向内质网应激的药物对肝衰竭治疗提供新思路。

7 内质网应激与肝衰竭的临床研究

肝衰竭进展过程中内质网应激反应的临床研究较少。 基因分析显示，在慢加急性肝衰竭(ACLF)患者中内质网应激或下游通路相关基因，包括BiP、ATF4、PERK等表达存在差异[29]。另一项研究显示，与肝硬化患者相比，ACLF患者内质网应激相关基因XBP1、细胞凋亡和炎症相关基因(caspase-3、caspase-8、TNFα)>2倍上调[30]。有学者对内质网应激在乙型肝炎病毒相关ACLF中的作用进行了研究，电镜观察ACLF肝细胞超微结构显示内质网结构扩张和破裂。在慢性乙型肝炎患者中，三条UPR通路均被激活；在ACLF中，ATF6通路的表达被激活，而PERK和IRE1的表达下调。此外，ACLF肝内质网应激相关的凋亡分子CHOP、caspase-4、Bax表达明显上调，而GRP78、GRP94表达逐渐降低[31]。这些研究显示内质网应激相关分子在ACLF中异常改变，表明内质网应激参与ACLF的病理机制。然而内质网应激在ACLF中的作用还需要更多的临床研究进行证实。

8 展望

随着近年关于内质网应激与肝衰竭之间关系的研究深入，越来越多的研究证明两者存在密切联系。ERS是机体的一种自我保护性反应，适应性ERS是维持内质网稳态的自我保护机制，持续或严重的ERS可加重细胞损伤。ERS在肝细胞中的功能复杂，可调控炎症反应、氧化应激反应等，这些反应与肝衰竭的发病机制密切相关。大量的肝衰竭动物研究表明，内质网应激分子表达上调，而且运用内质网应激抑制剂可改善肝衰竭动物的肝损伤。因此目前动物的研究表明，内质网应激可能参与调控肝衰竭的病理过程，内质网应激抑制剂有可能作为治疗肝衰竭的新靶点。目前关于内质网应激和肝衰竭临床的研究较少。但仅限的临床研究结果显示，内质网应激相关分子在ACLF中异常表达。这些研究表明，内质网应激在肝衰竭的病理过程中发挥重要作用。由于内质网应激通路分子较多，筛选出有价值的内质网应激分子药物可为治疗肝衰竭提供新思路。