新生儿1,25-二羟基维生素D3与CMVI及预后的关系*

邱锐琴，夏明月，韩雁雁，杜志云，姚文秀

(河北省秦皇岛市第一医院：1.新生儿科；2.儿科 066000)

新生儿时期巨细胞病毒感染(CMVI)主要分为围生期和宫内感染(先天感染，病毒经胎盘传播)[1]。CMVI的发病机制尚不十分清楚，有研究证实可能与免疫功能异常有关[2]。CMVI后病毒会侵入各种靶器官，包括中枢神经系统、肝脏、眼等，造成多器官损伤，存活者可能会遗留智力障碍、耳聋及其他神经系统后遗症[3]。因此，对CMVI及其预后进行有效评估，从而针对个体采取治疗措施，具有重要临床意义。1,25-二羟基维生素D3[1,25-(OH)2D3]是维生素D3的一种活性形式，可调节机体免疫功能及调控肿瘤细胞增殖、分化、凋亡，一定程度上也可反映人体免疫水平[4-5]。但目前并无1,25-(OH)2D3在新生儿CMVI中的研究。因此，本研究通过检测新生儿血清1,25-(OH)2D3水平，并探讨其水平与CMVI及预后的关系，以为评估CMVI及预后提供参考指标。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2016年3月至2019年7月于本院就诊的60例初发CMVI新生儿为研究对象(CMVI组)，年龄1～16 d，平均(10.63±3.46)d，男32例，女28例；选取同期75例健康新生儿作为对照组，年龄1～16 d，平均(10.72±3.53)d，男39例，女36例。两组新生儿年龄、性别比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。纳入标准：(1)CMVI的诊断参照2012年《儿童巨细胞病毒性疾病诊断和防治的建议》[6]；(2)肝炎病毒、风疹病毒、单纯疱疹病毒及呼吸道病毒等常见病毒的抗体均呈阴性；(3)临床病例资料记录完整清晰者。排除标准：(1)先天性严重心、肝、肾功能障碍者；(2)近4周内使用过糖皮质激素等免疫抑制剂者；(3)因其他原因不能参加本研究者。本研究中CMVI均由主治以上医师明确诊断，本试验经本院临床研究伦理委员会批准，符合伦理学标准，所有受试对象均由专业人员详细告知家长研究内容并同意参加，并签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1主要试剂与仪器

1,25-(OH)2D3酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(批号：0-119553)、异硫氰酸荧光素(FITC)anti-human CD3(批号：ANT-137)，购自上海将来实业股份有限公司；白细胞介素17(IL-17 )ELISA试剂盒(批号：GTX37136)，购自北京孚博生物科技有限公司；转化生长因子β1(TGF-β1)ELISA试剂盒(批号：PE051)，购自上海歌凡生物科技有限公司；PE/Cy7-γδT(批号：HT1610611)，购自深圳市豪地华拓生物科技有限公司；FITC anti-human CD4(批号：85-11-0049-71)，购自上海意杰生物科技有限公司；PE anti-human CD25(批号：305445)，购自上海信裕生物科技有限公司。BD FACSCalibur流式细胞仪，购自上海实维实验仪器技术有限公司。

1.2.2样品采集及保存

CMVI组于入院后、对照组于体检时抽取清晨空腹静脉血样，3 000 r/min离心15 min后收集血清，置于-80 ℃保存待测；同时用密度梯度离心法获取单个核细胞，于3 h内采用流式细胞仪检测。

1.2.3血清1,25-(OH)2D3、IL-17和TGF-β1水平测定

采用ELISA法检测受试者血清1,25-(OH)2D3、IL-17和TGF-β1水平，操作步骤严格按照试剂盒使用说明书进行。

1.2.4γδT细胞和Treg细胞表达水平测定

取单个核细胞均分至两个流式管(管1和管2)，分别加入2 mL磷酸盐缓冲液(PBS)，1 500 r/min离心5 min，弃上清液，重复1次。管1加荧光标记抗体FITC anti-human CD3与PE/Cy7-γδT各5 μL，管2加荧光标记抗体FITC anti-human CD4与PE anti-human CD25各5 μL，混匀，避光孵育15 min，弃上清液，重复1次，加PBS重悬，取200 μL置于流式细胞仪检测γδT细胞和Treg细胞表达。

1.2.5随访

随访1年，60例CMVI新生儿中47例临床好转或痊愈；2例进行听觉脑干诱发电位检查时发现听觉受损；1例先天性角膜白斑；2例有高热抽搐发作，脑电图证实为癫痫，讲话口齿不清；8例分别在8个月内死于肝硬化和肝衰竭。根据CMVI新生儿预后情况，将其分为好转或痊愈组(n=47)和异常或死亡组(n=13)。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 两组新生儿一般资料比较

两组新生儿年龄、性别、出生体重、早产比例、分娩方式比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 两组新生儿一般资料比较

2.2 两组新生儿1,25-(OH)2D3、TGF-β1、IL-17、Treg、γδT水平比较

CMVI组γδT、IL-17水平高于对照组；1,25-(OH)2D3、Treg、TGF-β1水平低于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 两组新生儿1,25-(OH)2D3及TGF-β1等水平比较

2.3 CMVI新生儿1,25-(OH)2D3与TGF-β1、IL-17等水平的相关性

CMVI新生儿1,25-(OH)2D3与Treg、TGF-β1呈正相关(r=0.532、0.498，P=0.002、0.012)，与γδT、IL-17呈负相关(r=-0.512、-0.476，P=0.008、0.016)。

2.4 不同预后CMVI新生儿1,25-(OH)2D3、TGF-β1等水平比较

异常或死亡组患儿γδT、IL-17水平高于好转或痊愈组(P<0.05)；1,25-(OH)2D3、Treg、TGF-β1水平低于好转或痊愈组(P<0.05)，见表3。

表3 不同预后CMVI新生儿1,25-(OH)2D3、TGF-β1等水平比较

2.5 影响CMVI新生儿预后的多因素分析

将CMVI新生儿是否好转或痊愈作为因变量，以1,25-(OH)2D3、Treg、TGF-β1、γδT、IL-17水平为自变量进行多因素logistic回归分析。结果显示，γδT是CMVI新生儿好转或痊愈的危险因素，1,25-(OH)2D3是CMVI新生儿好转或痊愈的保护因素，见表4。

表4 影响CMVI新生儿预后的多因素分析

3 讨 论

CMVI在我国广泛流行，且多发生于新生儿时期[7]。巨细胞病毒是一种双链DNA病毒，具有典型的疱疹病毒形态，对免疫系统尚未发育完善的新生儿常表现为显性感染，可侵害新生儿身体多个脏器，如神经系统、肝脏、肺等，并对免疫缺陷患儿生命造成严重威胁[8]。目前，CMVI的病理机制并不明确，但研究表明，免疫细胞和各种细胞因子可能在CMVI的免疫应答过程中发挥重要作用[9]。

维生素是人体必需的一类微量有机物，只能从食物中摄取，参与人体生长、发育及代谢过程[10]。维生素D3是一类脂溶性固醇类维生素，其在人体内的最终活性形式为1,25-(OH)2D3，血清1,25-(OH)2D3可作为衡量人体内维生素D3水平的有效指标[11]。1,25-(OH)2D3不仅可以提高机体对钙、磷的吸收，促进骨骼钙化和生长，还可通过调节Th1、Th2和调节性T细胞的细胞活动，诱导细胞优势免疫应答，从而在机体免疫功能调节中发挥重要作用[12]。本研究结果显示，CMVI新生儿γδT、IL-17水平高于健康新生儿，1,25-(OH)2D3、Treg、TGF-β1水平低于健康新生儿，且CMVI新生儿1,25-(OH)2D3与Treg、TGF-β1呈正相关，与γδT、IL-17呈负相关。γδT、Treg、TGF-β1、IL-17均是与炎症及免疫调节有关的细胞及细胞因子，可稳定机体免疫平衡[13-14]。DAGUZAN等[15]研究发现，γδT细胞在CMVI后数目增多，较对照组升高；徐玲等[16]研究结果显示，CMVI组γδT和IL-17水平高于对照组，Treg、TGF-β1水平低于对照组，均与本研究结果一致。提示与健康新生儿比较，CMVI新生儿机体炎性反应处于激活状态，且免疫功能异常，而1,25-(OH)2D3可调节机体免疫功能，推测其可能机制为：(1)当新生儿处于病理状态时，1,25-(OH)2D3需求量增加，导致其浓度降低；(2)1,25-(OH)2D3分泌量减少使其受体传递信号减弱，Th1细胞活动增强，Th2和调节性T细胞活动减弱，从而诱导出Th1优势免疫应答，介导细胞免疫，诱导免疫排斥，使新生儿发生CMVI。此外，本研究结果中异常或死亡新生儿γδT、IL-17水平高于好转或痊愈新生儿，1,25-(OH)2D3、Treg、TGF-β1水平低于好转或痊愈新生儿，且γδT是CMVI新生儿好转或痊愈的危险因素，1,25-(OH)2D3是CMVI新生儿好转或痊愈的保护因素，提示1,25-(OH)2D3与Treg、TGF-β1、γδT、IL-17均与CMVI新生儿的预后有密切联系，临床中应尤其注意1,25-(OH)2D3、γδT水平的变化，以便及时采取针对性合理治疗措施。

综上所述，血清1,25-(OH)2D3水平与新生儿CMVI及预后密切相关，临床上可通过密切监测其水平来评估CMVI及预后，对CMVI新生儿及时采取针对性合理治疗措施、改善CMVI预后、降低新生儿病死率可能有指导意义。由于本研究为回顾性研究，存在较多遗失病例，部分因素分析可能不够全面，还需进一步扩大样本研究。另外1,25-(OH)2D3影响CMVI及预后的病理机制也需进一步探究。