siRNA沉默EZH2对HL-60细胞迁移、增殖能力的影响及其机制*

朱秋花，潘学谊，曾文彬，周兰兰，关则兵

(广东药科大学附属第一医院血液内科，广州 510080)

初诊的急性髓系白血病(AML)患者中有30%～40%可伴有髓外浸润(EMI)，EMI主要表现为淋巴结肿大、皮肤结节、齿龈增生、中枢神经系统的侵犯及肝脾肿大等[1]。急性早幼粒细胞白血病(APL)占成人AML的10%～15%，具有特殊的生物学和遗传学特征。APL常起病较凶险，有10%～20%的患者死于早期出血。EMI在APL中发生不少见，且研究显示EMI与AML患者预后差相关[2]。作为多梳家族蛋白(PcG)中具有催化活性的亚基，果蝇zeste基因增强子的人类同源基因2(EZH2)是主要起组蛋白甲基转移酶的作用，通过甲基化修饰核小体组蛋白H3K27位点赖氨酸调节细胞分化、增殖及肿瘤的形成[3-4]。有研究发现，EZH2在多种恶性实体肿瘤如肾癌、肺癌及甲状腺癌迁移及预后差相关[5-7]，且有研究报道EZH2抑制剂在体外有抗白血病作用[8]。但是EZH2在白血病的作用及其参与EMI的机制研究较少。本课题前期研究证实人APL细胞系HL-60和Kasumi-1细胞均高表达EZH2，且已通过实验证实在Kasumi-1 细胞株中EZH2促进其细胞迁移、增殖，抑制其凋亡[9]。本研究旨在探究EZH2对HL-60细胞迁移、增殖能力的影响及可能的机制，以为APL的表观遗传学治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料及试剂

55例初治AML患者骨髓单个核细胞标本来源于南方医院血液科。HL-60细胞购自天津血液病研究所。细胞的培养基为含有10%新生牛血清(杭州四季青公司，中国)的RPIM-1640培养基(Hyclone,USA)，并添加100 U/L青霉素、100 μg/L 链霉素；在含有37 ℃、5% CO2饱和湿度条件进行培养。RNA 提取试剂Trizol试剂盒及逆转录试剂盒均购自中国TaRaRa公司。EZH2和β-actin基因引物均由上海英俊捷基公司设计并合成。核蛋白/胞浆蛋白试剂盒购自中国弗德生物公司，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)单抗、EZH2单抗、基质金属蛋白酶2(MMP-2)单抗、H3K27me3单抗、E-钙黏蛋白(E-cadherin)单抗、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)单抗、GAPDH单抗均购自美国Cell Signaling Technology(CST)公司，二氨基联苯胺(DAB)显色液购自中国DAKO公司。能够敲除EHZ2的3种不同序列小干扰RNA(siRNA-1:AAC AGC TGC CTT AGC TTC A,siRNA-2:AAC AGC TCT AGA CAA CAA A,siRNA-3:GGA TAG AGA ATG TGG GTT T) 及对照组空病毒(NC：TTC TCC GAA CGT GTC ACG T)购自中国吉凯基因。

1.2 方法

1.2.1实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法检测EZH2表达

qRT-PCR方法检测AML患者骨髓EZH2 mRNA的表达水平，并分析其表达与临床特征的关系。

1.2.2建立敲除EZH2的HL-60细胞株

6孔板接种对数生长期的HL-60细胞，使每个孔细胞数为1×105个，HL-60细胞分别用3种不同序列siRNA的慢病毒(分别为siRNA-1组、siRNA-2组、siRNA-3组)及空载体慢病毒(为NC组，而未转染的HL-60则为wild组)转染，培养72 h后在荧光显微镜下拍照。随后流式细胞术用来检测细胞的绿色荧光蛋白(GFP)转染率，并筛选出GFP阳性的细胞，用qRT-PCR及Western blot验证3个不同序列的siRNA敲除EZH2的效果并筛选出最佳序列记为siEZH2组，体外扩大培养。

1.2.3Transwell实验检测细胞迁徙能力

细胞的迁移能力用Transwell迁移小室实验来检测，小室基底膜的孔径为8 μm。HL-60的3个处理组细胞株(wild、NC和siEZH2组)，用磷酸缓冲盐溶(PBS)分别洗涤细胞2次，RPIM-1640培养基重悬细胞使细胞浓度为3×106个/L。分别取3×105个细胞接种到Transwell小室的上室。下室加入500 μL各自细胞所需含有血清的正常培养基，在含有37 ℃、5% CO2饱和湿度条件下培养18 h后，对迁移到下室的细胞进行计数。同上处理各组细胞，培养时间为10 h。取出小室，用苏木素对小室膜上细胞进行染色，选择相同位置的5个视野进行计数并拍照。上述实验均重复3次。

1.2.4CCK8检测细胞增殖活性

CCK8实验用来检测细胞的增殖活性，将HL-60的wild、NC、siEZH2 3组对数生长期的细胞接种于96孔板，调整每孔细胞数为1×104个，各组设3个复孔。分别于0、24、48、72、96 h后加入CCK8试剂，培养3 h后在酶标仪下测定各孔450 nm吸光度(A)值，以上试验重复3次。

1.2.5流式细胞术检测细胞凋亡

细胞凋亡用细胞凋亡双标检测试剂盒膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(Annexin V-APC/PI)检测，用PBS液漂洗wild、NC、siEZH2 3组细胞，1×Binding Buffer漂洗细胞1次离心弃上清液，随后用100 μL 1×Binding Buffer重悬3组细胞，加5 μL Annexin V-APC，室温光孵育15 min。1×Binding Buffer漂洗细胞1次之后离心弃上清液，在200 μL 1×Binding Buffer重悬的3组细胞中加入5 μL PI；用流式细胞仪来检测细胞凋亡。

1.2.6qRT-PCR及Western blot方法检测相关基因及蛋白表达

采用qRT-PCR方法检测相关基因表达，具体方法同本课题组前期研究[10-11]。Western blot方法用来测定相关蛋白，取HL-60的wild、NC、siEZH2 3组细胞提取蛋白，蛋白浓度用二喹啉甲酸(BCA)法检测，行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)之后转膜，加入一抗在4 ℃冰箱孵育过夜，次日洗膜之后加入二抗孵育2 h。以GAPDH为内参，化学发光显色后拍照分析EZH2、组蛋白H3第27位赖氨酸上三甲基化(H3K27me3)、MMP-2及E-cadherin蛋白表达水平。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 AML患者EZH2表达水平与临床特征的关系

55例AML患者EZH2表达与临床特征的关系,在AML中高表达EZH2患者EMI发生率明显升高(P<0.01)，见表1。

表1 AML患者EZH2表达与临床特征关系

续表1 AML患者EZH2表达与临床特征关系

2.2 各组细胞EZH2的表达水平比较

在HL-60细胞中转染载有不同siRNA片段的慢病毒，培养72 h，荧光显微镜下拍照，见图1。qRT-PCR及Western blot检测EHZ2基因及蛋白表达均下调。siRNA-1组EZH2 mRNA(0.003 0±0.000 2)明显低于siRNA-3组(0.004 3±0.000 1)和siRNA-2组(0.006 4±0.000 6)，差异均有统计学意义(P<0.001)。 其中以siRNA-1(序列AAC AGC TGC CTT AGC TTC A)下调HL-60细胞的EZH2最明显，Western blot检测结果与PCR结果一致，流式筛选siRNA-1组GFP阳性细胞体外扩大培养用于后续实验,随后检测NC、siEZH2、wild 3组细胞EZH2的表达，qRT-PCR及Western blot结果均显示，siEZH2组EZH2表达均明显低于NC组及wild组(P<0.001)，见图2。

A:siRNA-1组；B:siRNA-2组；C:siRNA-3组。

a：P<0.001,与wild组比较；bP<0.001，与siRNA-1组比较。

2.3 各组HL-60细胞增殖活性及凋亡率比较

CCK8实验提示在HL-60细胞中敲除EZH2后siEZH2组的增殖能力明显下降(P<0.05)。通过流式细胞术检测细胞凋亡，发现siEZH2组细胞凋亡明显增加(P<0.05)，见图3。

a：P<0.05，与siEZH2组比较。

2.4 各组HL-60细胞敲除EZH2后细胞迁移能力比较

Transwell迁移实验中siEZH2组的下室细胞比例[(4.50±0.26)%]明显低于wild组[(9.05±0.30)%]和NC组[(9.03±0.27)%]，差异有统计学意义(P<0.001)；苏木素染色后发现siEZH2组小室膜上细胞基数比wild组和NC组明显降低，差异有统计学意义(P=0.001)，见图4。

a:P<0.001,与siEZH2组比较。

2.5 各组HL-60细胞敲除EZH2后H3K27me3和MMP-2蛋白水平比较

在HL-60细胞中敲除EZH2，H3K27me3和MMP-2蛋白均明显下调(P<0.05)，而E-cadherin则上调(P<0.05)，同时发现EZH2下调后抗凋亡蛋白Bcl-2亦下调,而细胞凋亡途径关键蛋白caspase-3上调，见图5。

图5 Western blot检测相关蛋白表达

3 讨 论

EZH2作为PcG蛋白家族成员之一，在多种肿瘤中起原癌基因作用。EZH2参与调节细胞分化、增殖及肿瘤的形成[3],有研究显示EHZ2与多种实体肿瘤迁移能力相关[5-7]。APL为白血病中一种特殊类型，EMI发生率较高，EMI中以中枢浸润较常见，一旦发生中枢侵犯预后较差。目前国内外有关APL与EZH2的关系及其EMI机制研究极少。本课题组前期研究已证实在AML细胞株HL-60及Kasumi-1存在EZH2高表达，且在Kassumi-1细胞中证实敲除EZH2细胞凋亡增加，增殖减慢，机制研究显示EZH2通过调控E-cadherin蛋白及p-ERK/p-cmyc/MMP-2通路影响细胞迁移[9-10]。且TANAKA等[11]研究显示，在HL-60细胞中下调EZH2可抑制其增殖。因此，本研究猜测EZH2与APL细胞增殖、凋亡及迁移相关。本研究旨在探究在HL-60中敲除EZH2对细胞的增殖、凋亡及迁移的影响及其可能的机制。

相对于实体肿瘤的迁移而言，在白血病中则表现为EMI，白血病一旦发生EMI则预后较差。MMPs、黏附分子、趋化因子及E-cadherin异常表达均可影响白血病细胞EMI。当骨髓中白血病细胞表面的黏附因子表达异常时其黏附能力下降促使细胞趋化黏附于血管内皮上，进而分泌MMPs促使细胞外基质降解，最终细胞迁移至骨髓外导致EMI[12-14]。相关研究表明，在AML中EMI的发生亦与MMPs表达增加密切相关[15-16]。EZH2可通过甲基化肾癌、口腔癌细胞核小体组蛋白下调E-cadherin表达从而增强细胞的转移能力[5，17]。本研究结果显示，在HL-60细胞中敲除EZH2后E-cadherin表达上调，MMP-2下调，细胞迁移能力减弱。因此，本研究认为EZH2可能通过上调HL-60细胞的MMP-2降解细胞外基质或通过下调E-cadherin来增强APL细胞迁移能力。

EZH2主要通过甲基化周期蛋白、抑癌基因等靶基因参与调节细胞分化增殖及肿瘤的形成[4]。林璐慧等[18]研究发现，敲除EZH2后HL-60细胞中H3K27me3亦下调从而导致Bcl-2下调促进细胞凋亡。Bcl-2是一种癌基因，具有抑制凋亡的作用。有研究报道，在HL-60细胞存在Bcl-2过表达，抑制Bcl-2的表达能够增加细胞凋亡关键基因caspase-3活性，进而抑制细胞增殖并促进其凋亡[19]。本研究发现，敲除EZH2后HL-60细胞的增殖减弱、凋亡增加。本研究认为，敲除EZH2后对组蛋白 H3K27的甲基化作用减弱，进而其对靶基因抑制作用减弱，从而引起Bcl-2下调及caspase-3上调。

综上所述，EZH2可能通过上调Bcl-2及下调caspase-3促进HL-60细胞增殖并抑制其凋亡。临床中使用去甲基化药物如地西他滨及阿扎胞苷治疗白血病可能基于表观遗传学调控，这为将来使用EZH2抑制剂或其他类型去甲基化药物治疗白血病提供一定理论基础，更深的机制研究仍需进一步探究。在APL细胞株(HL-60)中敲除EZH2能有效抑制其增殖和迁移能力,并促进其凋亡，且EZH2可能通过MMP-2及E-cadherin影响HL-60细胞的迁移能力,EZH2可能通过调节Bcl-2及caspase-3影响HL-60细胞增殖凋亡，这将为APL表观遗传学治疗提供新靶点。