综合平衡法分析脂肪酸组合对瘤胃微生物蛋白合成的组合效应

2021-06-09习瓒娜戴乐军王梦芝

中国饲料 2021年11期

习瓒娜，高健#，戴乐军，王梦芝*

（1.扬州大学动物科学与技术学院，江苏扬州225009；2.连云港生物工程中等专业学校，江苏连云港222065）

瘤胃微生物的种类多样，其中细菌和原虫的生物量较大，细菌占50%～80%、原虫占20%～50%，是主要的微生物区系，对宿主的影响也相对更有意义。瘤胃微生物通过厌氧发酵能够为宿主提供65%～75%的能量需要，并且瘤胃微生物与反刍动物生产效率紧密相关（米见对等，2019；Jiang等，2017；Shabat等，2016；Jami等，2014）。因此，对瘤胃微生物区系的调控是调控反刍动物消化代谢和生产的前提。研究发现，控制原虫的数量和组成可提高反刍动物的饲料利用率（王梦芝，2008），同时也可改变小肠氨基酸组成模式（韩春艳等，2002）。在日粮中添加脂肪酸或脂类可影响瘤胃的微生物区系及其发酵过程（Potu，2002），进而影响微生物蛋白的合成量（Soltan等，2018）。Abuelfatah等（2016）研究表明，日粮中亚麻籽的两种添加水平均显著降低了山羊瘤胃液中原生动物的数量。卢德勋（2004）对体外培养中多种发酵指标组合效应进行评估，提出用多项组合效应指数（MFAEI）将体外发酵所得的各项指标进行综合量化，以评定不同饲料间的组合效应，并利用粗饲料的分级指数，在最佳粗饲料配方的基础上优化精饲料的配方组合，科学有效地对反刍动物日粮配方进行系统优化（王旭，2003）。综合平衡法是分析多指标正交试验结果的分析方法之一（刘瑞江等，2010），其先对各个指标分别进行直观分析，找出其因素水平的最优组合，然后根据各项指标重要性及各项指标中所得出的因素主次、水平优劣等进行综合平衡，然后对各指标的分析结果进行综合比较和分析，能够合理确定各指标的权重，以得出最终优化水平（耿旭等，2018；刘俊娥，2013；刘振学等，2010）。研究表明，脂肪酸组合能够调控瘤胃挥发性脂肪酸的发酵模式（习瓒娜等，2019），但这些脂肪酸组合对微生物蛋白合成影响的组合效应鲜见报道。因此，本试验通过正交试验，研究不同脂肪酸组合体外培养对瘤胃微生物蛋白的调控效果，通过计算MFAEI反映脂肪酸之间的组合效应，并利用综合平衡法分析其最佳调控组合，为进一步研究脂肪酸对反刍动物瘤胃微生态机理的影响提供试验参考。

1 材料与方法

1.1 试验设计与底物培养试验共分10组，其中Ⅰ～Ⅸ组分别添加0.5%、1.0%、1.5%3个水平的硬脂酸、油酸、亚油酸、ɑ-亚麻酸进行正交试验（硬脂酸、油酸、亚油酸、ɑ-亚麻酸均购于国药集团化学试剂有限公司），与基础培养物（25.50%可溶性淀粉、4.25%木聚糖、4.25%阿拉伯聚糖、4.25%葡聚糖、4.25%甘露聚糖、32.00%纤维素、4.25%果胶、4.25%木质素、3.60%尿素、8.40%酪蛋白）混合，并用棕榈酸钙平衡能量，每组各设3个重复，另外设1个无底物的空白对照组Ⅹ。L9（34）正交试验设计与培养底物的组成参考Abuelfatah等（2016）报道，表1为各组培养底物中脂肪酸的含量。

表1 培养底物中脂肪酸含量%

1.2 试验动物与饲养管理在扬州大学现代实验农牧场选取3头体重相近、体况良好、装有永久性瘤胃瘘管的健康山羊羯羊作为瘤胃液供体，供体羊采用单栏饲养，饲粮组成为70%羊草、28%玉米、2%豆粕，干物质采食量为体重的2.5%，每日07：00和19：00两次等量饲喂，自由饮水。

1.3 体外培养与样品采集

1.3.1 瘤胃液的采集在晨饲前利用自制真空负压装置从3头瘘管羊各采集瘤胃液200 mL，过4层纱布，将过滤后的瘤胃液混合均匀，39℃水浴保温迅速送回实验室，即刻参照Menke等（1988）方法准备体外培养。

1.3.2 取样设计分别在培养后0、3、6、9、12、18、24 h取样，即刻测定pH并于-20℃冷冻保存，用于培养液NH3-N浓度、微生物蛋白、原虫蛋白和细菌蛋白的测定。

pH采用上海雷磁试验设备厂pHS-3C型pH计进行测定。NH3-N浓度采用冯宗慈（2010）的方法进行。微生物的分离与测定参照王梦芝（2008）的方法进行。

1.4 统计与分析试验数据用SPSS 25.0软件进行单因子方差分析（One-Way ANOVA），用Duncan’s法进行多重比较。采用极差分析法，得到最优水平。

2 结果

2.1 脂肪酸组合对体外培养瘤胃微生物pH的影响由表2可知，随时间点推移，各试验组培养液的pH总体呈下降趋势，并在5.40～7.02之间变化。时间点多重比较发现，各时间点组间差异均不显著（P＞0.05）。

表2 脂肪酸组合对pH的影响

2.2 脂肪酸组合对体外培养瘤胃微生物NH3-N浓度的影响由表3可知，随时间的延长NH3-N浓度呈波动变化，各组的变化不尽一致。氨氮浓度的均值以Ⅳ组最高，为15.53 mg/100 mL；Ⅱ组最低，为11.96 mg/100 mL。在3 h时，Ⅱ组、Ⅷ组和Ⅸ组显著低于Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组（P＜0.05）。其他各时间点差异不显著。

表3 脂肪酸组合对NH3-N浓度的影响mg/100 mL

2.3 脂肪酸组合对体外培养瘤胃微生物发酵微生物蛋白含量的影响由表4可知，微生物蛋白的含量随采样时间的延长，总体呈先上升再下降，最后上升的波动变化趋势，微生物蛋白含量为0.41～2.22 mg/mL时，其24 h均值则以Ⅱ、Ⅵ和Ⅶ组较高，除Ⅴ组外均高于对照Ⅹ组。时间点多重比较发现，各时间点各组之间差异均不显著（P＞0.05）。

表4 脂肪酸组合对MCP含量的影响mg/mL

由表5可知，极差R为0.27（ɑ-亚麻酸）＞0.16（硬脂酸）＞0.11（亚油酸）＞0.09（油酸），主次顺序依次为ɑ-亚麻酸、硬脂酸、亚油酸、油酸。其中0.5%硬脂酸、1.5%油酸、0.5%亚油酸、1.0%ɑ-亚麻酸对微生物蛋白含量的组合效果最好。

2.4 脂肪酸组合对体外培养瘤胃微生物发酵原虫蛋白含量的影响由表6可知，除Ⅴ组外，其他各试验组均值均高于对照组，其中，原虫蛋白量Ⅵ组均值最高，为0.92 mg/mL，Ⅴ组均值最低，为0.5 mg/mL。时间点间多重比较发现，各时间点组间差异均不显著（P＞0.05）。

表5 MCP含量组合分析表（24 h均值）

表6 脂肪酸组合对原虫蛋白含量的影响mg/mL

由表7可知，极差R为0.23（ɑ-亚麻酸）＞0.16（硬脂酸）＞0.14（亚油酸）＞0.08（油酸），主次顺序依次为ɑ-亚麻酸、硬脂酸、亚油酸、油酸。其中0.5%硬脂酸、1.5%油酸、0.5%亚油酸、1.0%ɑ-亚麻酸对原虫蛋白含量的组合效果最好。

2.5 脂肪酸组合对体外培养瘤胃微生物发酵细菌蛋白含量的影响由表8可知，各组中细菌的菌体蛋白总体呈上升趋势，VII组的平均细菌的蛋白量最高，为0.29 mg/mL；I组细菌蛋白平均值最低，为0.19 mg/mL。并且各组数据组间差异不显著（P＞0.05）。

表7 原虫蛋白含量组合分析表（24 h均值）

表8 脂肪酸组合对细菌蛋白含量的影响mg/mL

由表9可知，极差R为0.04（ɑ-亚麻酸）＞0.03（油酸）=0.03（亚油酸）＞0.01（硬脂酸），主次顺序依次为ɑ-亚麻酸、亚油酸、油酸、硬脂酸。其中0.5%或1.0%硬脂酸、1.5%油酸、1.5%亚油酸、1.0%ɑ-亚麻酸对细菌蛋白含量的组合效果最好。

2.6 组合效应综合评定指数结果由表10 MFAEI结果显示，除Ⅴ组外，其他添加不同浓度脂肪酸组合后发生了明显的正效应，产生正组合效应，其中以Ⅵ组最优（MAFEI=0.77）。

表9 细菌蛋白含量组合分析表（24h均值）

由表11可知，极差R为0.65（ɑ-亚麻酸）＞0.42（硬脂酸）＞0.32（油酸）＞0.20（亚油酸），主次顺序依次为ɑ-亚麻酸、硬脂酸、油酸、亚油酸。其中1.5%硬脂酸、1.5%油酸、0.5%亚油酸、1.0%ɑ-亚麻酸的组合效果最好。

2.7 综合平衡法分析经综合平衡法分析发现，当添加0.5%硬脂酸、1.5%油酸、0.5亚油酸、1.0%ɑ-亚麻酸时，对瘤胃发酵和瘤胃原虫、细菌蛋白等的组合效应最好

3 讨论

3.1 不同脂肪酸组合对体外培养瘤胃发酵参数的影响 pH可反映瘤胃发酵状况，关于本试验结果显示，培养液pH在5.40～7.02，适于瘤胃微生物的正常生长。体外培养瘤胃微生物，Ivan等（2013）研究表明，亚麻籽对瘤胃pH没有影响；Ebrahimi等（2017）发现，日粮中n-3：n-6脂肪酸的比例对山羊瘤胃pH无影响；Atikah等（2018）也发现，饲喂含不同脂肪酸的食用油对山羊瘤胃pH无显著影响。对添加3%的不同脂肪酸体外培养发现，pH差异也不显著（皮宇等，2014），这与本试验结果一致。这表明脂肪酸组合对瘤胃微生物pH无明显影响。氨能为瘤胃微生物生长提供氮源，是MCP合成的底物，氨氮浓度在一定程度上能表明微生物活力的强弱。Ortega等（1979）研究发现，瘤胃中NH3-N的最佳浓度为6.3～27.5 mg/100 mL。本试验中，氨氮浓度为11.96～15.53 mg/100 mL，适于瘤胃微生物的正常生长代谢，并且不同脂肪酸组合的体外培养对瘤胃NH3-N浓度无影响，这与其他试验结果相同（Atikah等，2018；Ebrahimi等，2017；皮宇等，2014）。

表10 组合效应综合评定指数结果%

表11 综合效应组合分析表（24 h均值）%

表12 综合平衡法分析%

3.2 不同脂肪酸组合对体外培养瘤胃微生物蛋白的影响原虫和细菌是主要的微生物区系，其生物量的高低关系着瘤胃发酵效果与宿主的消化代谢。不饱和C18脂肪酸能够改变瘤胃发酵模式和微生物种群分布（Zhang等，2008）。许多研究表明，日粮中添加脂肪酸能抑制瘤胃中原虫和部分菌群的生长，使微生物总量和活力改变，增加微生物蛋白的合成，从而引起瘤胃微生物菌群结构的变化，进而影响瘤胃的发酵（Fiorentini等，2014；Messana等，2013；Liu等，2011；王梦芝等，2010；Maia等，2010）。不饱和长链脂肪酸对原虫和细菌均有不同程度的抑制作用，且其对原虫的抑制效应随不饱和度的增加而增加，使得原虫生物量降低，进而抑制原虫吞噬细菌，改变瘤胃微生物区系（Ivan等，2013）。本试验结果发现，各组的MCP、原虫蛋白、细菌蛋白在组间均无显著差异。与本结果一致的是，精油组合对瘤胃液微生物蛋白的产生和原生动物数量没有影响（Newbold等，2004）；在日粮中添加3%大豆油或2%向日葵油与1%鱼油的混合添加也对微生物蛋白质合成没有影响（Vargas等，2017；Potu等，2011）。杨舒黎（2007）研究发现，豆油与胡麻油组合后比两种油单独添加时对瘤胃微生物的效果好，亚油酸缓解了亚麻酸对微生物的抑制作用。而本试验结果则可能是脂肪酸的混合添加有效改善了单一脂肪酸对微生物的抑制效应，从而降低了脂肪酸对瘤胃微生物的抑制程度。同时，这也证明了不同脂肪酸的混合添加比单一脂肪酸的添加更能有效改善脂肪对瘤胃发酵的影响（Jenkins，2008），这一定程度说明不同脂肪酸组合存在一定的组合效应。张一帆等（2019）采用体外产气法分析累积产气量和不同组合pH、干物质降解率（DMD）及MCP、NH3-N、VFA含量变化，计算SMAEI和MFAEI，根据MFAEI得出玉米秸秆青贮∶羊草∶燕麦草∶精饲料最优组合比例为10∶15∶25∶50。罗阳等（2018）通过测定体外瘤胃发酵的累积产气量、挥发性脂肪酸VFA、NH3-N、MCP和体外有机物消化率（IVDOM），计算MFAEI以综合评价桑叶和羊草的组合效应，从而得出桑叶和羊草能够改善体外瘤胃发酵参数，其中最佳比例为60：40。杨洪明等（2019）采用MFAEI，通过体外培养法测定培养液pH、体外产气量、体外干物质消化率、体外中心洗涤纤维（NDF）消化率，以综合评价不同GI指数的粗饲料和精饲料之间的组合效应，从而得出粗饲料之间玉米青贮和羊草的组合最为理想。本试验中，研究不同脂肪酸的组合效应对瘤胃微生物合成的调控作用，由于MCP、原虫蛋白、细菌蛋白与微生物合成密切相关，因此本试验中综合考虑这几个指标进行MFAEI分析。试验结果表明，添加不同浓度脂肪酸组合之间产生了正组合效应。

综合平衡法是分析多指标正交试验结果的分析方法之一（刘瑞江等，2010）。Ye等（2014）通过正交试验优化富含甘油酵母培养物的制备及其对山羊血液代谢和瘤胃发酵的影响，通过优化不同的葡萄糖浓度、氮源、尿素浓度、磷源、玉米浆干粉浓度和NaCl浓度，使甘油产量和总生物量达到最大，最终确定富含甘油的酵母培养物包含（38.7±0.6）g/L甘油和（12.6±0.5）g/L生物质。戚如鑫等（2019）运用综合平衡法分析稻草秸秆与白菜尾菜混合青贮对养分变化的影响，通过对干物质、粗蛋白质、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、粗灰分、可溶性碳水化合物的综合比较与分析发现，当稻草秸秆和白菜尾菜质量比为4：6、植物乳杆菌添加量为0.030 g/kg、纤维素酶添加量为0.25 g/kg时，有利于提升稻草秸秆与白菜尾菜混合青贮的养分。禄璐等（2018）采用综合平衡法研究影响喷雾干燥工艺制备枸杞鲜颗粒冲剂的各因素，确定了最佳工艺组合为进风温度140℃，给气量85%，进料速度28 mL/min，此条件下获得的枸杞鲜颗粒冲剂中枸杞多糖达4.05%，黄酮含量为0.081%，功效成分保持最好。本文通过对各个单指标（微生物蛋白、原虫蛋白、细菌蛋白及MFAEI）进行分析，然后对各个指标的分析结果进行综合比较发现，添加0.5%硬脂酸、1.5%油酸、0.5%亚油酸、1.0%ɑ-亚麻酸时，对瘤胃发酵和瘤胃原虫、细菌蛋白等的组合效应最好。通过主成分分析发现，这四种脂肪酸不同组合的体外培养对微生物蛋白、原虫蛋白、细菌蛋白影响的主次顺序中ɑ-亚麻酸都排在了第一位，说明在脂肪酸组合中，ɑ-亚麻酸对瘤胃微生物的影响起主导作用。这与Wang等（2019）和皮宇等（2014）发现ɑ-亚麻酸对瘤胃微生物的调控作用更大的结果一致，也再一次验证了不饱和长链脂肪酸对原虫的负作用随不饱和度的增加而增加（Ivan等，2013）。张娟（2019）发现，不同比例亚麻油与棕榈油的混合添加对绒山羊瘤胃内总细菌数量无显著影响，但会抑制部分细菌数量。这启示在接下来的试验中，还应该通过检查特定细菌种类来确定添加脂肪酸对瘤胃细菌的影响。