lncRNA XIST预警卵巢癌耐药和不良预后的应用价值探讨

陈翠兰，尹富强

卵巢癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤，是妇科病死率较高的恶性肿瘤之一[1]。据统计,2020年美国卵巢癌新增病例约21 750例，新增死亡病例约13 940例[2]，我国每年新增病例约52 100例，死亡病例约22 500例[3]。卵巢癌临床治疗通常是手术切除后采用一线化疗药物铂类和紫杉醇进行化疗，在初期通常能取得较好的效果。但随着化疗时间的延长，绝大多数卵巢癌患者会对化疗药物产生耐药，导致患者死亡，这是卵巢癌治疗失败和生存率低下的主要原因。因此，探索和鉴定影响卵巢癌耐药及预后的因子对于卵巢癌临床化疗方案的制定及临床预后具有重要指导意义。lncRNA XIST是X染色体非活性特异性转录本长非编码RNA[4]，已证明其在许多肿瘤中异常表达，影响肿瘤细胞增殖和分化，与肿瘤的发生、发展及化疗耐药密切相关[5]，但目前其与卵巢癌耐药及预后的相关研究仍较少。鉴此，本研究基于大数据挖掘分析和细胞实验，旨在探讨其与卵巢癌化疗耐药和预后的关联性，为进一步深入研究其调控卵巢癌耐药的机制和应用于临床提供理论依据。

1 材料与方法

1.1细胞培养 人卵巢癌敏感细胞HeyA8和SKOV3为课题组实验室保存。卡铂耐药细胞HeyA8-CBP(HeyA8卡铂耐药细胞)和SKOV3-CBP(SKOV3卡铂耐药细胞)及紫杉醇耐药细胞HeyA8-R和SKOV3-R由课题组实验室构建[6]。细胞培养基为含有10%胎牛血清、100 units/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的RIMP 1640完全培养基，于5% CO2，37℃恒温细胞培养箱中进行培养。每天观察细胞生长情况以及状态，待细胞汇合度达80%左右时采用0.05%胰酶进行消化传代，3～4 d传代一次。

1.2细胞总RNA提取及反转录 采用TRIzol法提取细胞总RNA，应用NanoDrop分光光度计测定RNA浓度和纯度。随后应用cDNA第一链合成试剂盒(Takara,R407A)将总RNA逆转录为cDNA，-20 ℃冰箱保存备检，实验操作严格按照试剂盒说明书进行。

1.3实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)检测 应用RT-qPCR检测试剂盒(Takara,R820A)检测细胞lncRNA XIST的表达水平，以GAPDH作为内参，所用引物序列见表1。检测结果采用2-ΔΔCt法进行计算分析。

表1 引物序列

1.4大数据挖掘和分析

1.4.1 卵巢癌组织和正常卵巢组织的lncRNA XIST表达水平比较分析 基于Oncomine数据库[7](https://www.oncomine.org/resource/main.html)，选择能检测到lncRNA XIST表达的全部6组卵巢癌表达谱芯片，以P<0.01和fold>2为阈值，选择浆液性(serous)卵巢癌样本和正常卵巢组织样本，最终纳入3组芯片(Welsh表达谱芯片、Adib表达谱芯片、Bonome表达谱芯片)进行比较分析。

1.4.2 lncRNA XIST与卵巢癌患者预后及耐药的相关性分析 基于整合了15组来自GEO和TCGA数据库的独立表达谱芯片(GSE23554、GSE63885、GSE3149、GSE15622、GSE14764、GSE27651、GSE65986、GSE51373、GSE18520、GSE26712、GSE9891、GSE19829、GSE26193、GSE30161和TCGA)，共包含1 815例卵巢癌样本，采用Kaplan-Meier plotter和ROC plotter[8-9]分析lncRNA XIST表达与卵巢癌预后及耐药的关联性。在1 815例卵巢癌样本中，不同的亚组所包括的样本数不同，以实际分析纳入的样本数为准。Kaplan-Meier plotter预后分析中，lncRNA XIST的高表达和低表达以数据库自动最佳阈值划分；样本选择上不分层，包括了所有不同分期、分级、手术、化疗的样本，不限于某一亚组。ROC plotter耐药相关性分析中，以化疗后6个月是否复发作为敏感或耐药的划分依据[9]，无其他过滤和分层的限制。化疗药物的分组上，本研究纳入了四组，即所有药物(any drug)组、铂类药物(platin)组、紫杉醇(taxane)组及铂类药物+紫杉醇(platin+taxane)组。

2 结果

2.1卵巢癌组织和正常卵巢组织的lncRNA XIST表达水平比较 基于Oncomine数据库的3个独立卵巢癌表达谱芯片结果显示，与正常卵巢组织相比，卵巢癌组织的lncRNA XIST表达水平下调2倍以上。与正常卵巢组织比较，在Welsh表达谱芯片中卵巢癌组织的lncRNA XIST表达水平下调10.653倍(t=5.545,P=0.000)，在Adib表达谱芯片中下调2.041倍(t=3.147,P=0.008)，在Bonome表达谱芯片中下调2.565倍(t=7.055,P=0.000)。见图1。

图1 三组独立卵巢癌表达谱芯片(Welsh、Adib及Bonome)中卵巢癌组织和正常卵巢组织的lncRNA XIST表达水平比较图

2.2卵巢癌lncRNA XIST表达水平与患者预后的关联性分析结果 通过Kaplan-Meier plotter分析卵巢癌lncRNA XIST表达水平与患者预后的关联性，结果显示，与lncRNA XIST高表达组相比，lncRNA XIST低表达组在总生存期(overall survival，OS)、无进展生存期(progression-free survival，PFS)和进展后生存期(post-progression survival，PPS)方面的预后更差(P<0.05)。见图2。

图2 Kaplan-Meier plotter分析结果图

2.3卵巢癌敏感细胞与耐药细胞的lncRNA XIST表达水平比较 RT-qPCR检测结果显示，与卵巢癌亲本细胞HeyA8及SKOV3相比，lncRNA XIST在紫杉醇耐药细胞HeyA8-R和SKOV3-R及卡铂耐药细胞HeyA8-CBP和SKOV3-CBP中均显著下调(下调倍数>26，P<0.001)。见图3。

H：HeyA8细胞；H-R：紫杉醇耐药细胞HeyA8-R；H-C：卡铂耐药细胞HeyA8-CBP；S：SKOV3细胞；S-R：紫杉醇耐药细胞SKOV3-R；S-C：卡铂耐药细胞SKOV3-CBP。H vs H-R(t=131.065,P=0.000)，H vs H-C(t=163.410，P=0.000)，S vs S-R(t=30.475，P=0.000)和S vs S-C(t=26.907，P=0.000)

2.4lncRNA XIST预警卵巢癌化疗耐药分析结果 基于GEO和TCGA数据库数据分析比较lncRNA XIST在卵巢癌耐药组织(non-responder)和敏感组织(responder)中的表达水平，结果显示，在对所有药物、铂类药物、紫杉醇以及铂类药物+紫杉醇4个分组中，耐药组织的lncRNA XIST表达水平均显著低于敏感组织(P<0.05)。ROC plotter分析结果显示，对于所有药物耐药，lncRNA XIST的预警截断值为8 977；对于铂类药物耐药，lncRNA XIST的预警截断值为8 977；对于紫杉醇耐药，lncRNA XIST的预警截断值为8 245；对于铂类药物+紫杉醇耐药，lncRNA XIST的预警截断值为8 245。见图4。

图4 lncRNA XIST预警卵巢癌化疗耐药分析结果图

3 讨论

3.1lncRNA是一类长度>200 bp的非编码RNA，具有丰度高、物种保守性低、组织表达特异和作用方式多样等特点，被认为是生命活动中的重要调控因子，可通过直接或间接作用于靶基因、调节组蛋白进行修饰和染色质重塑，也可作为内源竞争性RNA等方式发挥作用[10]。进而通过调控药物外排、DNA损伤修复、细胞凋亡、诱导药物靶标突变等过程调节肿瘤耐药并影响患者预后[11]。如lncRNA GAS5[12-13]、lncRNA TP73-AS1[14]、lncRNA CCAT1和lncRNA MALAT1[15]等，均已证明在卵巢癌进展及耐药调控中发挥着重要作用，并对卵巢癌患者预后产生影响。lncRNA GAS5是细胞凋亡和生长抑制的关键因子，通常作为分子诱饵阻止糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor，GR)和糖皮质激素反应元件(glucocorticoid response element，GRE)结合，调控基因表达，进而影响细胞周期和凋亡[12]。lncRNA TP73-AS1能够通过影响Zeste基因增强子同源物基因2(enhancer of Zeste homolog 2,EZH2)和组蛋白第27位氨基酸甲基化(H3K27me3)与P21启动子区的结合，沉默P21基因的表达，促进上皮性卵巢癌细胞的增殖和迁移侵袭能力，抑制细胞凋亡，进而调控上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer，EOC)的进展[16]。lncRNA CCAT1能够靶向多个mircoRNA，通过CCAT1-miR-152/miR-130b/ADAM17/Wnt1/STAT1/ZEB1轴和CCAT1/miR-490-3p/TGFβR1轴对卵巢癌发挥调控作用[17]。lncRNA MALAT1在卵巢癌中上调表达可使PHF19沉默进而抑制细胞增殖，通过靶向mircoRNA-211来阻滞细胞周期增加细胞凋亡，进而抑制卵巢肿瘤细胞生长迁移，参与卵巢癌调控[18]。

3.2本研究结果显示，lncRNA XIST与肿瘤进展及预后具有显著关联。Kobayashi等[19]研究显示，lncRNA XIST的表达与接受铂类药物放化疗的宫颈鳞状细胞癌患者的OS相关，lncRNA XIST高表达预示更好的OS。在卵巢癌中，与卵巢上皮细胞相比，lncRNA XIST在50%的卵巢癌细胞中表达缺失[20],而其上调表达具有显著的抗肿瘤活性，可能通过吸附miR-214-3p而发挥作用[21]。本研究通过表达谱芯片数据的挖掘与分析，结果显示lncRNA XIST在卵巢癌组织中显著下调表达，且lncRNA XIST低表达与卵巢癌患者不良预后显著相关，提示卵巢癌lncRNA XIST低表达有作为预后标志物应用于临床的潜在价值。

3.3另外，本研究结果显示lncRNA XIST与肿瘤耐药相关。在直肠癌中，与高表达组相比，lncRNA XIST低表达组患者对5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)化疗的耐药率更高[22]，提示lncRNA XIST低表达可能与肿瘤耐药调控相关。而与原发性卵巢癌相比，lncRNA XIST在复发性肿瘤中下调至少6.7倍以上，lncRNA XIST低表达与紫杉醇耐药正相关[23]。与上述研究结果相似，本研究结果显示，lncRNA XIST在紫杉醇耐药细胞HeyA8-R和SKOV3-R及卡铂耐药细胞HeyA8-CBP和SKOV3-CBP中均显著下调，且基于卵巢癌的数据库分析结果表明，lncRNA XIST在卵巢癌耐药组织中显著下调，且具有预警卵巢癌对铂类、紫杉醇以及其他药物耐药发生的价值，对临床治疗用药具有一定的指导价值。但值得注意的是，也有研究[24]表明，敲低lncRNA XIST表达能够通过抑制细胞自噬来增强非小细胞肺癌细胞对化疗药物的敏感性，从而抑制细胞耐药。上述两种不同结论可能与不同的肿瘤类型有关，在不同的肿瘤中，lncRNA XIST扮演着癌基因或抑癌基因的不同角色[4]。

综上所述，lncRNA XIST在卵巢癌卡铂/紫杉醇耐药细胞、耐药卵巢癌组织及卵巢癌组织中均显著下调，且其低表达具有预警铂类和紫杉醇等化疗药物的耐药，并与卵巢癌患者的不良预后显著相关，具有较好的临床潜在应用价值。