丹皮酚对VEGF和SDF-1在糖尿病大鼠视网膜上表达的干预作用

周倩倩，唐 颖

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)是糖尿病的常见并发症，也是中老年人视力丧失的主要原因之一[1]。炎症是DR的关键病理过程，链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)诱导的糖尿病大鼠发病早期即可在视网膜血管中检测到白细胞黏附增加导致淤积，并且与内皮损伤和血-视网膜屏障的破坏相关[2]。当DR进展到新生血管形成时，称为增生性糖尿病视网膜病变(proliferative diabetic retinopathy,PDR)。研究[3]证实血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)在介导新生血管方面扮演重要角色，抗VEGF药物的出现彻底改变了PDR的治疗方式，已经成为多种新生血管性眼病的一线用药。然而，抗VEGF药物较短的半衰期需要每月注射以确保治疗效果，给患者带来了沉重的经济负担和精神压力，这也凸显了寻找不同治疗靶点的重要性[4]。基质细胞衍生因子-1(stromal cell derived factor-1,SDF-1)是一种具有趋化活性的细胞因子，由骨髓基质细胞合成，与趋化因子受体4(chemokine receptor 4,CXCR-4)结合可促进形成新生血管。此前的研究主要集中在DR患者的玻璃体SDF-1浓度与病变程度的关联性，抑制SDF-1对DR的进展是否存在抑制作用仍有待进一步证实。丹皮酚又称牡丹酚，是毛茛科植物牡丹根皮的提取物，在心血管系统中已有较深入的研究，对急性炎症反应有抑制作用[5]，但其对DR作用的研究较少。鉴此，本研究旨在观察丹皮酚对STZ诱导的糖尿病大鼠视网膜SDF-1和VEGF表达的影响，初步探讨丹皮酚发挥DR治疗作用的可能机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1实验动物与分组 选择7～8周龄，体重180～200 g雄性健康美国斯泼累格·多雷(Sprague Dawley,SD)大鼠36只，均由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供。随机分为正常对照组(CON组)、丹皮酚组(DPF组)和糖尿病组(DM组)，每组12只。按干预时长不同，各组又再分为1月组、3月组和5月组，每组4只。

1.2动物模型构建 SD大鼠于无特定病原体(specific pathogen free，SPF)级实验动物房饲养，禁食12 h。DM组糖尿病大鼠模型的制备：用新鲜配置的柠檬酸盐缓冲液(浓度1%，pH4.3)稀释STZ(北京博爱港公司)，按65 mg/kg一次性腹腔注射，诱导建立糖尿病大鼠模型。若大鼠餐后2 h血糖<16.7 mmol/L则再重复注射STZ一次，剂量为10 mg/kg。再次注射后第3天测餐后血糖，以两次餐后2 h血糖浓度>16.7 mmol/L定义为糖尿病大鼠模型构建成功。CON组大鼠以等体积柠檬酸盐缓冲液一次性腹腔内注射，7 d后测餐后血糖值，以餐后2 h血糖值<16.7 mmol/L确定纳入CON组。血糖监测均通过尾静脉采血，测前尾部碘伏棉签消毒，测后涂擦金霉素眼膏，仪器为美国强生OneTouch SureStep血糖仪。

1.3干预方法 (1)DPF组：糖尿病模型建立成功3 d后，每周按4.32 mg/kg予丹皮酚颗粒(三九药业)溶解液3 ml灌胃。(2)DM组：糖尿病模型建立成功3 d后，第3天始每周予生理盐水3 ml灌胃。(3)CON组：在相应时点每周予生理盐水3 ml灌胃。药物干预后立即予以充分的水和食物，普通大鼠饲料喂养。每日定时更换垫料保持鼠笼内干燥，预防感染。定期检查大鼠体重、毛色、饮食和尿量等情况。饲养过程中各组均无大鼠死亡。

1.4样本采集和保存 各组大鼠到干预期限后，禁食12 h测量血糖，以10%水合氯醛腹腔注射麻醉，经心脏灌注4%多聚甲醛后处死老鼠取出眼球。于锯齿缘后0.5 mm处剪开眼球壁，去除眼前节和玻璃体。将剩余巩膜和视网膜组织浸入2.5%戊二醛溶液固定1周。将眼球壁以视乳头为中心切4块，在显微镜(Nikon-SMZ1500，日本)下剥离出视网膜，用锋利刀片迅速切取横切面约1 mm2的长条形小块标本，于上方12点方位角巩膜缘缝线标记，置于4%多聚甲醛固定液中固定24 h，用于石蜡切片。

1.5苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色法 将石蜡切片置于二甲苯(Ⅰ)15 min，二甲苯(Ⅱ)中15 min脱蜡。梯度酒精脱蜡至水：100%酒精10 min，95%酒精10 min，85%酒精10 min，70%酒精10 min，蒸馏水冲洗10 min。苏木素染液染色2～3 min，水洗玻片多余染液。1%盐酸酒精分色片刻，镜检控制直至细胞核及核内染色质清晰，约数十秒钟，自来水冲洗。蒸馏水洗后入伊红染液染色2 min，自来水冲洗。梯度酒精脱水：切片入70%酒精3 min，85%酒精3 min，95%酒精3 min，100%酒精3 min。置于二甲苯(Ⅰ)、二甲苯(Ⅱ)中透明各1 min。擦去切片多余二甲苯，滴加中性树胶，再加盖玻片封固。高倍镜(×20，Nikon-SMZ1500，日本)下观察三组视网膜切片中的细胞核，随机计数5个不同区域的突破内界膜的血管内皮细胞核数的均值，玻璃体腔内其他与内界膜无关系的血管内皮细胞核不包括在内。

1.6SDF-1和VEGF检测 采用实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)法检测SDF-1和VEGF的mRNA表达。使用RNA提取试剂盒(EZ-press RNA Purification Kit,美国EZBioscience公司)抽提细胞总RNA，经逆转录为cDNA用于后续反应，逆转录试剂盒购自美国EZBioscience公司。根据美国国家生物信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)数据库的资料信息进行SDF-1、VEGF和18S(内参)引物设计，序列见表1，由生工生物工程股份有限公司合成。以每组3个复孔，重复3次进行实时定量PCR检测。以2-ΔΔCt法进行数据分析处理。

表1 引物序列

2 结果

2.1三组大鼠处死前各时点餐后2 h血糖水平比较 在经不同干预时长后，DM组和DPF组处死前的餐后2 h血糖水平均显著高于CON组(P<0.05)，但DM组与DPF组比较差异无统计学意义(P>0.05)。提示糖尿病大鼠模型建立成功。见表2。

表2 三组大鼠处死前各时点餐后2 h血糖水平比较

2.2三组大鼠各时间点视网膜突破内界膜的细胞核数比较 DM组和DPF组大鼠视网膜突破内界膜的细胞核数均较CON组显著增加(P<0.05)。DM组和DPF组的视网膜突破内界膜的细胞核数随干预时间的延长而增加，且DPF组各时间点的细胞核数均显著少于DM组(P<0.05)。见表3，图1。

表3 三组大鼠各时间点视网膜突破内界膜的细胞核数比较个/视野]

图1 干预5月时各组视网膜突破内界膜HE染色图片(×20)

2.3三组大鼠各时间点视网膜SDF-1、VEGF mRNA表达水平比较 在干预1个月、3个月和5个月时间点，DM组SDF-1 mRNA和VEGF mRNA的表达水平均显著高于CON组和DPF组(P<0.05)，DPF组表达水平稍高于CON组，但差异无统计学意义(P>0.05)。见图2。

ⓐSDF-1 mRNA相对表达水平；ⓑVEGF mRNA相对表达水平；*表示差异有统计学意义(P<0.05)

3 讨论

3.1DR是一种微血管异常的病变，内皮细胞核会突破视网膜内界膜移行到缺血缺氧部位产生新的毛细血管。本研究中HE染色发现DM组大鼠视网膜毛细血管内皮细胞的细胞核突破内界膜数量较多，而DPF组数量尽管高于CON组，但较DM组有所降低，说明丹皮酚对于内皮细胞核的移行起到一定的抑制作用。

3.2丹皮酚是丹皮的提取物，具有镇痛、抗炎、解热和抑制变态反应的作用，是一种药理活性广泛、高效低毒的药物[5]。孙国平等[6]研究发现丹皮酚在体外有细胞毒性作用，灌胃给药有抗肿瘤作用。杨骅等[7]研究发现丹皮酚具有血管内皮保护作用，可以预防物理造成的血管内皮损伤。朱作金等[8]发现丹皮酚雾化吸入可以提高大鼠肺局部非特异性免疫功能。但关于丹皮酚对视网膜血管的作用机制的研究较少。本研究RT-qPCR检测结果显示，DPF组SDF-1、VEGF mRNA表达水平低于DM组，介于DM组与CON组之间，提示丹皮酚可以一定程度上抑制VEGF和SDF-1的表达。

3.3SDF-1是由骨髓基质细胞合成、具有趋化活性的细胞因子，能够促进血管的生成。CXCR-4分属于G蛋白耦联化学因子受体，且是SDF-1的惟一受体。SDF-1与CXCR-4结合形成SDF-1/CXCR-4生物轴，表达于血小板及内皮细胞，诱导新生血管的生成。SDF-1与CXCR-4特异性结合后，参与介导炎症反应、造血干细胞(hematopoietic stem cell，HSC)迁移及归巢[9]。有研究[10-11]发现，通过皮下注射SDF-1/CXCR-4轴阻断剂，可以导致细胞因子失去归巢能力，组织修复功能降低，继而阻碍新生血管的生成。另外，有研究[12]显示SDF-1α能够显著刺激VEGF和CXCR-4在骨髓来源间充质干细胞的表达，而外周血中存在的CD34+细胞来源于骨髓，其是具有与HSC大量相同表面抗原的细胞群，在体内可被缺血动员，并移行至缺血组织，参与新生血管的生成。SDF-1的调节可改善糖尿病患者急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)后的心脏修复，这提示SDF-1、CXCR-4在新生血管形成过程中具有其他细胞因子难以比拟的重要作用。

3.4研究[13]表明，SDF-1和DR关系密切，玻璃体中SDF-1的集聚与视网膜病变、黄斑水肿程度有直接的关系。SDF-1/CXCR-4途径可能通过增加细胞活力来改善DR[14-15]。也有研究[16-17]发现,PDR患者玻璃体内VEGF与SDF-1的表达与非PDR患者相比均有明显升高,而有糖尿病黄斑水肿的患者玻璃体SDF-1浓度更高。而实验研究[17]表明，在阻断VEGF作用后，单独SDF-1眼内注射可造成DR，且即使存在外源性VEGF，玻璃体内注射针对SDF-1的封闭抗体也可以防止视网膜新生血管形成。本研究发现，DM组大鼠视网膜中SDF-1、VEGF mRNA表达水平高于DPF组和CON组，且干预时间越长，表达水平差异越显著，与相关研究[18-19]结论相符。表明丹皮酚能够抑制SDF-1的表达，通过SDF-1/CXCR-4轴及一系列信号通路，抑制VEGF的表达，减少新生血管的生成，对于DR的发生、发展能够起到一定的抑制作用。

综上所述，丹皮酚可以通过下调糖尿病大鼠视网膜中SDF-1和VEGF的表达来抑制视网膜新生血管形成，且作用时间较为持久，对DR的发生、发展具有抑制作用。