中性粒细胞胞外诱捕网在癌症中的作用

张 克，刘 瑶

（1. 赣南医学院2018级硕士研究生；2. 赣南医学院第一附属医院消化内科，江西 赣州 341000）

癌症是人类健康的主要威胁之一。全球癌症的统计数据显示，2018 年新增1 810 万癌症病例，960 万死亡病例［1］。近年来，由于不良因素如吸烟、酗酒、腌制食品和缺乏运动等影响，癌症的风险正在迅速增长。

中性粒细胞是一种在外周血中所占比例最大的白细胞。它们具有趋化、吞噬、杀菌等功能。当局部组织受到细菌等侵害时，中性粒细胞在趋化因子等作用下，穿越血管壁进入炎症组织，并大量聚集。这些细胞可吞噬和消化入侵病原体，构成人体第一道免疫防线［2］。

一些研究发现在肿瘤组织中存在大量中性粒细胞。FADY C 等［3］发现，肿瘤组织中的中性粒细胞可作为免疫细胞，具有潜在抗癌功能。而另一项研究表明，一些中性粒细胞可促进肿瘤的侵袭和转移［4］。随后的研究发现，这种双重作用可能归因于肿瘤相关中性粒细胞（Tumor associated neutrophil，TAN）的2种不同亚型：抗肿瘤型中性粒细胞（N1）和促肿瘤型中性粒细胞（N2）。具有抗肿瘤效应的N1可通过释放高水平的超氧化物和过氧化氢等诱导细胞毒性作用，破坏肿瘤细胞并抑制肿瘤生长［5］；N2中性粒细胞可通过释放大量免疫调节因子，如精氨酸酶、血管内皮生长因子和基质金属蛋白酶9 等促进肿瘤发生发展［6-7］。在这两种肿瘤相关中性粒细

胞中，N1的作用引起了研究人员的主要关注。最近研究发现，由N1 形成的中性粒细胞胞外诱捕网（Neutrophil extracellular traps，NETs）可能在抑制癌细胞转移和侵袭中起关键作用。研究NETs 在肿瘤发生发展中的作用机制可为癌症提供新的治疗靶标。本文对NETs及它在癌症中的作用进行综述。

1 NETs

1.1 NETs 简介2004年BRINKMANN V 等［8］首次发现一种由中性粒细胞诱导形成的网状结构，并命名为中性粒细胞胞外诱捕网（Neutrophil extracellular traps，NETs）。NETs 由直径15～17 nm的平滑纤维和直径25 nm 的球状结构组成，且外周无膜结构包被。在细菌脂多糖、真菌、病毒和激活的血小板等作用下，中性粒细胞会向胞外释放去聚化的DNA，并以此为骨架，镶嵌多种蛋白，共同构成NETs（见 图1）［9］。这些蛋白主要包括组蛋白（Histones）、中性粒细胞弹性蛋白酶（Neutrophil elastase，NE）、髓 过 氧 化 物 酶（Myeloperoxidase，MPO）、基质金属蛋白酶9、组织蛋白酶G（Cathepsin G，CG）等多种抗菌蛋白（见表1）［10］。

图1 中性粒细胞和NETs

表1 NETs的构成组分

在体内，中性粒细胞形成NETs 有两种模式：①自杀式NETs：中性粒细胞受到炎症刺激，通过磷脂肌醇信号途径（PKC）激活NADPH 氧化酶和Raf/MERK/ERK 信号通路，进而刺激活性氧类物质（reactive oxygen species,ROS）产生，在肽酰基精氨酸脱亚氨酶（Peptidylarginine deiminase4，PAD4）诱导下，组蛋白瓜氨酸化（Citrullinated histone H3，H3Cit）导致核染色体解聚。此过程耗时2～4 h。②活体式NETs：中性粒细胞的细胞核膜和细胞膜的完整性不被破坏，且不依赖于ROS 的产生和Raf/MERK/ERK信号通路的激活。此过程耗时5～60 min。Toll 样受体、补体C3 蛋白可能是触发此种类型的刺激因素，释放NETS 后的中性粒细胞仍具有吞噬病原体的能力，且其寿命不受影响。

1.2 NETs 检测方法目前，一般通过定性、定量检测手段评估NETs 形成。定量方法有：①既往国内外学者们通过PicoGreen 荧光分光光度法检测血浆游离DNA（cf-DNA）来评判NETs 形成［11］，虽然PicoGreen 荧光染料法是一种灵敏的双链DNA 检测方式，通过检测仪可检测到pg 级的微量DNA，但这种检测方法因不能排除其它形式细胞死亡产生的DNA 的干扰，所以不能精确评判NETs 的形成［12］；②酶联免疫吸附试验（ELISA）是近年来具有较高特异性、稳定性的NETs定量检测方法，一般是测量NETs来源蛋白（H3Cit、MPO、NE）和DNA 复合物［13-14］。定性方法有：①免疫印迹法通过比较NETs 标志蛋白（H3Cit、MPO、NE）的相对表达水平来评价NETs 的生成；②免疫荧光激光共聚焦法通过分析DNA 和NETs 标志蛋白（H3Cit、MPO、NE）共定位的荧光图实现NETs 定性/半定量检测，可直观观察到NETs 网状结构，是区分NETs 与细胞凋亡、坏死等机制的最可靠方法［15-17］。

2 NETs在肿瘤发病过程中的作用

2.1 NETs 与肿瘤发生在肺癌中，肿瘤相关中性粒细胞和细胞外染色质积累形成NETs，会促进肺癌发生［18］。有报告显示，在原发性肿瘤和结肠癌转移性淋巴结内的切片中有大量NETs［19］。与正常对照组相比，荷瘤小鼠的血浆中产生NETs 更多［20］。肿瘤细胞通过分泌G-CSF、IL-8 等细胞因子直接诱导NETs 形成［21］。在胰腺癌小鼠和动脉导管未闭患者的胰腺肿瘤中观察到瓜氨酸化组蛋白表达，是NETs形成的标志。自噬是胰腺癌细胞存活的重要调节因子，吞噬受体dectin1 通过促进吞噬体形成使NE远离细胞核，抑制NETs 形成［22］。晚期糖基化终产物（Receptor for advanced glycation end products，RAGE）受体介导胰腺肿瘤微环境的自噬，促进肿瘤发生。用氯喹抑制自噬或RAGE敲除术可降低瓜氨酸化组蛋白表达，降低胰腺肿瘤微环境下的NETs形成倾向［23］。因此，可推论NETs 在胰腺癌中是通过RAGE依赖/自噬途径促进肿瘤的发生发展。

文献研究发现，HMGB1 和组蛋白通过TLR4/9信号通路促进NETs 生成［24-26］，发挥促进肿瘤生长和粘附循环肿瘤细胞，诱导结肠癌肝内微小转移病灶形成［27］。非酒精性脂肪性肝炎（Nonalcoholic steatohepatitis，NASH）患者血浆中MPO-DNA 含量明显增高，在链脲佐菌素与高脂饮食诱导的小鼠NASH 模型的肝脏中可检测到中性粒细胞浸润和游离脂肪酸（Free fatty acids，FFA）水平增加，且棕榈酸和亚油酸等FFA 可诱导NETs 形成，随后伴有巨噬细胞浸润和炎性细胞因子生成，最终导致肝癌［28］。

2.2 NETs与肿瘤转移NETs可通过物理作用，将循环肿瘤细胞和内皮细胞锚定，有利于肿瘤细胞与内皮细胞粘附。干扰这种相互作用，可以有效减少肿瘤细胞跨内皮渗出和远端器官转移。动物实验证实，诱导NETs 可促进肿瘤细胞在肺部及肝脏形成转移结节；而使用DNase 酶切割NETs 的DNA 骨架，或使用NE 抑制剂抑制NETs 形成，可显著减少远端器官转移结节形成。COOLS-LARTIGUE 等在盲肠结扎和穿刺的败血症肺癌小鼠模型中发现了大量NETs，与无感染对照组相比，实验组小鼠转移风险明显增加，这种效应可通过NETs 的降解酶DNaseI 来消除。体外实验证实A549 肺癌细胞在NETs存在下迁移和侵袭增加。循环中NETs可通过招募血小板保护转移性细胞，为转移肿瘤细胞提供了便利。

2.3 NETs 与肿瘤相关血栓肿瘤通过产生组织因子（Tissue factor，TF）促进血小板活化，活化的血小板通过P-选择蛋白直接结合中性粒细胞上的P-选择素糖蛋白配体（PSGL-1），依赖TLR4 机制介导NETs 生成［29］。P-选择蛋白能促进PMN 中ROS 产生，这一过程对该选择蛋白诱导NETs 有着十分关键的作用（Etulain2015）。P-选择蛋白缺乏小鼠的血小板不能诱导NETs 形成，而P-选择蛋白高表达的小鼠血小板与中性粒细胞共培养时更容易诱导NETs 形成。活化的血小板促进中性粒细胞脱颗粒和吞噬作用，刺激中性粒细胞生成NETs，NETs 通过提供血小板粘附、活化和凝血酶生成的支架引发血栓形成［29］。ABDOL RAZAK 等发现胰腺癌细胞可快速诱导NETs 生成而不依赖于ROS 的产生，且血小板能促进上述作用［30］。他们还进一步评估了血小板在胰腺癌中诱导NETs 的作用，并观察到胰腺癌细胞激发的血小板能使NETs释放增多。

此外，NETs 在静脉切断应激下促进血栓形成，即PaCa 诱导的NETs 很大可能使PaCa 患者并发静脉血栓栓塞，并可将NETs 视为潜在治疗靶点。综上所述，血小板与NETs 两者相互影响，共同在癌症的发生发展过程中起着一定作用。THOMAS 等利用深静脉血栓（Deep venous thrombosis，DVT）小鼠模型，排除了肿瘤细胞衍生的肿瘤微粒体（microparticles，MPs）不需要P-选择蛋白及血管性血友病因子（Von willebrand factor，VWF）来诱发DVT 发生。在静态或流动条件下，MPs 可在体外粘附在NETs 上，DNaseI 处理可防止MPs 粘附，而MPs 在其表面表达足够的TF，可推断，NETs 将MPs 引入病理性血栓形成部位［31］。因此，针对它们的招募或活性可提供策略来预防与癌症相关的血栓并发症发生。

3 针对NETs的肿瘤治疗

①脱氧核糖核酸酶Ⅰ（Deoxyribonuclease Ⅰ，DNase Ⅰ）是核酸内切酶，能催化DNA 和双链DNA降解。DNA 作为NETs 的骨架，DNase Ⅰ降解NETs已被用作多种实验。报道表明DNase Ⅰ已在临床应用于治疗儿童和成人的囊性纤维化和脓胸［32］，目前无患者健康产生显著影响的报道，这表明它作为一种药物是安全的。②染色质解聚的过程取决于组蛋白瓜氨酸化，而这一过程是由PAD4 调控，WANG 等设计了一种PAD4 抑制剂，不仅抑制肿瘤生长，也抑制癌相关血栓形成［33］。③动物实验证实，NETs 的形成能促进肺和肝转移结节的形成，使用DNase Ⅰ或NE 抑制剂，可显著减少远端器官转移瘤的形成［34］。④肝素长期以来一直被用于临床治疗，其抗凝血作用可防止组蛋白介导的血小板聚集［35］，破坏NETs 稳定性，可能是一种治疗手段。⑤针对活化的血小板与NETs 形成的相互作用，干预P-选择蛋白/PSGL-1可能是一种潜在的治疗策略。

综上所述，NETs可逮捕并杀灭病原微生物保护机体不受侵害，但在恶性疾病进程中更倾向于产生负面影响，如血栓、术后转移和癌症复发等。然而，目前仍然不清楚当癌症患者遭受感染风险后，NETS的抗感染作用和促癌作用哪个更重要。DNase Ⅰ或PAD4 抑制剂，成为阻断NETs 形成的新治疗靶点。这些抑制剂在遏制肿瘤的转移和复发的同时，是否还会减弱宿主抵御病原微生物的入侵能力，需要进一步的研究。