青海互助县某村新引进仔猪腹泻病原的分子鉴定分析

张学勇，简莹娜，马怡隽，付永，沈秀英，郭志宏，陈有录，林芳明,朵红

(青海大学畜牧兽医科学院，西宁 810016)

仔猪腹泻是养猪业中常见的疾病，也是导致仔猪死亡最主要的原因之一，但是引起仔猪腹泻的因素较多，包括非传染性因素和传染性因素。非传染性因素包括母猪方面的健康状态、泌乳情况以及饲养管理因素。仔猪方面包括初乳获得、诱食补饲及应激因素的影响。环境方面的温度与湿度，保健卫生消毒及气候骤然变化等[1]。传染性因素就是致病性病原的作用，如细菌性病原：C 型魏氏梭菌(仔猪红痢)、致病性大肠杆菌(仔猪黄痢、仔猪白痢)、猪密螺旋体与肠道内厌氧菌(猪血痢)、沙门氏菌(仔猪副伤寒)、耶尔森氏菌、劳森菌(猪增生性肠炎)等[2]；病毒性病原包括猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪博卡病毒以及呼吸道猪冠状病毒、圆环病毒、伪狂犬病毒、猪瘟病毒等[3]；寄生虫性病原包括：球虫、蛔虫、隐孢子虫、贾第鞭毛虫、线虫等[4]。目前，虽然临床上治疗仔猪腹泻的药物很多，但多数情况下却简单采用抗生素类药物治疗，有时不能做到有效治疗，同时基层兽医临床中缺少必要的实验室诊断方法，不能准确诊断出致病性的各种病原。

猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus,PEDV)是一种以引起仔猪呕吐、腹泻和脱水为主要临床症状的高死亡率、高度传染性的肠道病毒。PEDV属于套式病毒目冠状病毒科α冠状病毒属的单股正链 RNA病毒，基因组长约2.8kb，由4个结构蛋白(纤突蛋白S、包膜蛋白E、膜蛋白M和核衣壳蛋白N)和3个非结构蛋白(ORF1a、ORF1b和ORF3)共同组成，PEDV有G1和G2[5]两种基因型。PEDV于1971年在英国报道暴发流行，之后在德国、比利时、瑞士、韩国和日本等养猪国家报道流行[4,6]。我国于1976年首次报道了PEDV的发生流行，2008—2018年我国18个省、市、地区PEDV感染分析显示：PEDV的阳性率为48.12%，混合感染阳性率为19.06%，我国中部地区PEDV混合感染率高于其他省市，冬季(12—2月)为PEDV混合感染多发季节[7,8]。猪圆环病毒(Porcine Circovirus,PCV)属于圆环病毒科(Circoviridae)圆环病毒属(Circovirus)的DNA病毒，其基因组为环状单链DNA分子，长度约为1767/8 bp，主要有Rep和Cap两个蛋白编码基因，完成病毒的复制和基因组组装等功能[9,10]，血清型分为PCV1和PCV2，PCV1型无致病性，PCV2型是主要毒株，可引起仔猪呼吸困难、皮肤苍白、消瘦腹泻等临床症状，并引起多种继发感染症状，称为断奶仔猪多系统衰竭综合征，也可使病猪出现免疫抑制，导致其他病原继发感染[9,11]。

本研究通过病猪临床症状和解剖病变情况，初步认为由病毒感染所致，是否有其他病原如PCV2、猪伪狂犬病毒、猪蓝耳病病毒和猪瘟病毒混合感染无法准确判断。故进行仔猪腹泻样品的PCR分子鉴定，确诊病原，针对病原采用合理有效的救治预防，为有效防治仔猪腹泻提供科学参考依据。

1 材料与方法

1.1 病料采集

青海省互助县某村散养户从同一养殖场同一时间购进一批仔猪饲养，购进3d后猪群普遍发生腹泻并出现死亡病例，采集腹泻粪便样品4份保存于冰盒后及时运至实验室进行分析。

1.2 主要试剂仪器

本次试验所用试剂如下：粪便基因组DNA提取试剂盒(DP328)和病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒(DP315)购自天根生化科技(北京)有限公司；2×TransStart PCR SuperMix(AS111)试剂、反转录试剂盒EasyScript® First-Strand cDNA Synthesis SuperMix(AE301)和Trans2K® DNA Marker(BM101)购自北京全式金生物技术有限公司；PCR引物合成及PCR产物测序均由苏州金唯智生物科技有限公司完成；其他均为国产常规试剂。本次试验所用的主要仪器包括PCR仪、Nanodrop 2000超微量分光光度计、电泳仪、凝胶成像分析系统、离心机、微量移液器等。

1.3 分子鉴定

利用天根粪便基因组DNA提取试剂盒对粪样进行基因组DNA的提取，具体的操作步骤参考试剂盒说明书，基因组DNA于-20℃中保存备用。同时，按照病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒中提供的操作手册，提取粪样中的总RNA，再利用反转录试剂盒反转录合成cDNA。病原鉴定用特异性引物见表1。以提取的基因组DNA/cDNA为模板，采用特异性引物进行PCR扩增，反应体系(50.0μL)如下：PCR SuperMix 25.0μL，上下游引物(浓度10.0μM)各2.0μL，模板DNA 3.0μL，补充水18.0μL；反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s、退火40s，温度见表1，72℃延伸1～2min，共35个循环，最后72℃延伸10min。扩增后PCR产物在1.5%的琼脂糖凝胶中进行电泳(电压120V，时间35min)，电泳完成后在凝胶成像仪中观察结果并拍照。

1.4 基因序列比较与进化分析

PCR阳性产物测序委托金唯智生物科技有限公司完成，采用Sanger法进行双向测序。测序结果经过测序峰图分析校正后，在GenBank上采用BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)方法进行同源序列搜索比对，应用Clustal Omega (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)在线软件进行核苷酸序列同源性的分析。利用MEGA 5.0软件采用邻接法(Neighbor-Joining)构建系统发育树，选择Kimura 2 parameter模式，进行重复2000次的自举检验，从遗传进化角度分析不同地区的病毒、细菌和虫株的亲缘关系及其进化特点。

表1 PCR分子生物学鉴定所用引物

2 结果

2.1 分子鉴定结果

基于大肠杆菌16S rRNA 基因和沙门氏菌invA基因进行PCR扩增，均未扩增到预期大小的目的片段；基于细菌通用引物扩增出1500bp的目的片段(如图1A)，经过测序BLAST比对分析后均为环境菌，非致病性细菌；基于隐孢子虫18SrRNA 基因、贾第鞭毛虫β-giardin 基因和球虫属ITS-1基因进行PCR扩增，均未扩增到预期大小的目的片段；基于猪流行性腹泻病毒N基因进行PCR扩增出约750bp的目的片段(如图1B)，测序分析均为PEDV(PEDV-QHHZ1)；基于猪圆环病毒2型Cap基因克隆引物进行PCR扩增出约700bp的目的片段(如图1C)，测序分析均为PCV-2型(PCV2-QHHZ1)；其他病毒进行PCR扩增，均未扩增到预期大小的目的片段。

图1 PCR鉴定结果

2.2 基因同源性分析

测序后在GenBank上采用BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)方法进行同源序列搜索，应用Clustal Omega (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/ clustalo/)在线软件进行核苷酸序列同源性的分析，扩增测序的PEDV-QHHZ1的N基因与参考序列黑龙江HM2017株、吉林CH/JLDH/2016株同源性高达99.47%，与其他株的同源性也都在97.47%以上。扩增测序的PCV2-QHHZ1的cap基因与参考序列河北Tsh2014株的同源性高达99.72%，与其他株的同源性也都在99.43%以上。

2.3 基因进化树分析

分别对PEDV的N基因和PCV的cap基因构建系统进化发育树，结果显示，本研究鉴定的PEDV-QHHZ1与黑龙江HM2017株、吉林CH/JLDH/2016株亲缘关系较近，聚成一支(如图2)；本研究鉴定的PCV2-QHHZ1与河北Tsh2014株和美国39869-NC-201507株亲缘关系较近，聚成一小分支，明显区分于PCV1和PCV3，仅与PCV2聚成一大支(如图3)。

图2 基于PEDV的N基因的进化树分析(黑点代表本研究鉴定分离株序列)

图3 基于PCV的cap基因的进化树分析(黑点代表本研究鉴定分离株序列)

3 讨论

在非洲猪瘟疫情发生的情况下市场中仔猪数量在下降，价格却在上涨，仔猪的健康状况对养猪业的发展至关重要。但是，仔猪腹泻已成为养猪业中重要的常见病，也是导致仔猪死亡的最主要的原因之一。本研究为了快速诊断仔猪腹泻病原，做出预防治疗方案，特进行仔猪腹泻相关病原的分子鉴定。

通过对腹泻相关细菌病原和寄生虫病原的分子鉴定后，结果均为阴性，基本排除这两类病原。在病毒病原的分子检测中，PEDV和PCV2这两种病毒病原为阳性。仔猪感染PEDV后主要引起腹泻、呕吐等临床症状，PCV2主要引起仔猪多系统衰竭综合征，同时可造成免疫抑制，临床上亦可表现为腹泻症状[11]。根据实验室分子鉴定诊断结果可判断，导致该村引进仔猪发病的主要原因是PEDV和PCV2混合感染。在青海省境内，PEDV的流行资料较少，仅有80年代的文献报道PED在乐都县、民和县、互助县、平安县、湟中县、湟源县和西宁市(含大通)地区的发病率为25.0%，死亡率占18%，其中仔猪发病率占80%[12]。近期，PCV2在青海贵德地区的感染调查显示，PCV2抗体检测的平均阳性率为95.89%，PCV2病毒核酸检测的阳性率为100%[13]。可见，对这两种病原的流行病学调查资料较少，同时发现PCV2存在普遍感染现象。PCV2在仔猪中常表现隐性感染，引起一定的免疫抑制，仔猪处于亚健康状态，容易引起其他病原的继发感染。本群仔猪同时感染PEDV，这种病原的混合感染导致的疫病临床症状更加复杂，在基层很容易造成漏诊或误诊，延误疫病的预防治疗，造成巨大的经济损失。

所以，在面对仔猪群混合感染了PEDV和PCV2时，对发病猪进行有效隔离，对病死猪扑杀无害化处理，同时进行紧急免疫接种疫苗。平时加强仔猪饲养管理，做好饲养环境改善，勤除粪、多消毒、讲卫生，减少猪群的应激影响因素(温度、湿度、氨气浓度)。提高猪群的饲料营养水平，使用有效的药物预防方案。利用实验室分子鉴定诊断技术准确确定引起仔猪发病的病因，然后采取相应的紧急措施，降低疫病发生流行概率，减少养殖户的经济损失。