高原型牦牛ACACA基因多态性与泌乳性状的关联分析

孙永刚，桂林生，吴森，韩银仓

(1.青海大学畜牧兽医科学院 青海省高原家畜遗传资源保护与创新利用重点实验室，西宁 810016；2.青海大学农牧学院，西宁 810016)

牦牛是青藏高原及毗邻地区集役、肉、奶、皮、绒等为一体的特有畜种，我国牦牛存栏数约1400万头，占世界存栏总数的95%以上，青海省又是第一牦牛大省，有牦牛500万头，占牦牛总数的37.7%，是牧民生产和生活资料的主要来源[1]，牦牛乳不仅是牦牛犊生存的必需品，也是牧民日常生活的主要食品之一，牦牛乳与普通牛乳相比其营养价值更为丰富，脂肪、蛋白质、乳糖、维生素、矿物质及必需氨基酸等营养素含量均高于普通牛乳[2]，其中牦牛乳蛋白含量高达4.0g/100g，钙含量高达132mg/100g，共轭亚油酸含量占总脂肪酸的0.92%，高于普通牛乳(0.40%～0.79%)，另外牦牛乳还有低致敏性，钙磷比为1.72∶1，多种活性生长因子等特点[3]。

乙酰辅酶 A 羧化酶 α(acetyl-CoA carboxylases alpha,ACACA) 是ACACA基因编码的脂肪酸从头合成的关键限速酶，在脂肪酸代谢过程中起到重要调控作用，主要在脂肪生成活跃的组织表达，如肝脏、脂肪组织和乳腺。牛的ACACA基因位于第19号染色体q13-q14上，基因全长约 289k bp，包含56个外显子和55个内含子[4]。目前，有关ACACA基因的结构、功能及表达调控等方面都有报道，研究表明，ACACA基因突变影响畜禽乳、肉品质性状及乳中脂肪酸组成，西班牙Churr绵羊ACACA基因15个SNPs显著影响乳中脂肪酸的组成，4个SNPs显著影响乳蛋白率和乳脂率[5]，山羊第45外显子C-T突变对乳脂量和乳糖量都存在差异[6]，崂山奶山羊ACACA基因启动子PⅢ位点突变乳蛋白率、乳糖率、乳密度、305d产奶量存在不同程度的影响[7]。荷斯坦奶牛和绵羊ACACA基因位点突变显著改变乳中脂肪酸含量[8,9]。ACACA基因g.2274G>A位点突变与韩牛眼肌面积呈显著性相关[10]。

本试验利用DNA测序技术分析ACACA基因的多态性，通过生物统计学软件，对多态位点基因频率、基因型频率、平衡性、群体遗传性及牦牛泌乳性状的相关性进行了统计分析。筛选出了对牦牛泌乳性状有重要影响的功能基因和分子标记，以期为牦牛的育种提供重要的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料采集及泌乳性状指标检测

血样采自青海省海北州祁连县默勒镇和野牛沟乡，随机选择健康的产乳牦牛235头，颈静脉采血10 mL，并采集乳样，样品采集完毕后置于-80℃ 保存，然后使用TIANamp Blood DNA kit试剂盒(天根，北京)进行DNA提取。

1.2 牦牛ACACA基因PCR扩增

根据GenBank 公布的牛ACACA(AC-000176.1),利用 Primer 5.0 软件设计引物(表1)，由上海生工生物工程技术服务有限公司负责合成。

PCR反应体系30.0μL，包括：含有核酸染料的dNTPs、Taq DNA聚合酶、10×Buffer的Mix 15.0μL，ddH2O 11.8μL，上游、下游引物各(10pmol/μL)0.6μL、模板DNA(50ng/μL)2.0μL。PCR反应条件如下：95℃预变性5min；94℃30s，64.5℃退火30s，72℃30s，35个循环；72℃延伸10min，4℃保存。PCR扩增产物用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.3 SNP检测

将扩增好的PCR产物送至上海生工生物工程技术服务有限公司进行纯化并测序，测序结果使用Seqman软件进行对比分析，寻找突变位点。

表1 引物序列信息

1.4 数据统计分析

根据基因型统计分析结果计算基因型、等位基因频率、多态信息含量(PIC)、遗传杂合度(He)和有效等位基因数(Ne)，并进行Hard-Weinberg平衡适应性检验。同时，使用HAPLOVIEW3.32软件对ACACA基因2个SNP位点进行连锁不平衡分析及单倍型分析。采用SPSS17.0软件中的GLM分别对ACACA基因的SNP位点的基因型与高原型牦牛泌乳性状(乳蛋白率、乳脂率和乳糖率)进行相关性分析，采用邓肯法 (Duncan’s) 进行均数间的多重比较。结果用平均数±标准误 (X±SE) 表述，以P<0.05 为差异显著水平。具体分析模型如下：表型观察值=群体均值+基因型效应+胎次效应+季节效应+随机误差。

2 结果

2.1 ACACA基因多态位点的遗传学分析

牛ACACA基因位于第19号染色体上，基因全长289257 bp，含56个外显子。通过测序分析发现，ACACA基因5’UTR上存在2个SNP，分别命名为g.43478T>A(图1-A)和g.43569C>T(图1-B)。

图1 (A)g.43478T>A基因型测序图 (B)g.43569C>T基因型测序图

如表2所示，本研究分析了这2个SNP位点的基因型频率、等位基因频率、杂合度、有效等位基因数和多态信息含量的遗传指标，并进行卡方检验检测Hardy Weinberg平衡状态。结果显示，ACACA基因g.43478T>A处，TT为优势基因型，而CC是g.43569C>T的优势基因型。卡方检验表明，这两个突变位点均处于Hardy Weinberg平衡状态(P>0.05)，且为中度多态(0.50>PIC>0.25)。

表2 ACACA基因突变位点多态信息

2.2 ACACA基因SNP位点的不同基因型对高原型牦牛泌乳性状的影响

将235头高原型牦牛的3个泌乳性状分别与ACACA基因突变位点的基因型进行关联分析。结果显示(表3)，g.43478T>A位点上的AA基因型泌乳性状表现最优，乳脂率均值极显著高于TT基因型(P<0.01)，而乳蛋白率均值则显著高于TT基因型均值(P<0.01)。g.43569C>T位点上的不同基因型的泌乳性状差异不显著(P>0.05)。

表3 ACACA基因突变位点与泌乳性状关联性分析

2.3 ACACA基因SNP位点的单倍型和连锁不平衡分析

通过软件对ACACA基因上2个SNP位点进行单倍型分析，总共检测到4种单倍型，分别为Hap1-Hap4(表4)。其中单倍型Hap1的发生频率最高，达到0.503，其次为单倍型Hap2和单倍型Hap3，发生频率分别为0.207和0.169。

表4 ACACA基因突变位点单倍型分析

此外，通过连锁不平衡分析发现，这2个SNP位点两两间的r2值小于0.330(表5)。基于r2值大于0.330，反映两者间具有较强的连锁不平衡效应的原则，因此，本文发现的2个SNP位点间不存在强的连锁性。

表5 ACACA基因突变位点连锁不平衡分析

2.4 ACACA基因SNP位点双倍型对高原型牦牛泌乳性状的影响

经分析得出，ACACA基因中2个SNP位点共有12种双倍型，将发生频率低于5%的7种合并基因型定义为其它类型，并进行删除(表6)。将其余的双倍型进行关联性分析后发现，双倍型H2H2个体的乳脂率极显著高于双倍型H1H1(P<0.01)，并且显著高于双倍型个体H1H2和H1H2(P<0.05)。因此，在本试验群体中，双倍型H2H2可被视为一种最为优秀的双倍型。

表6 ACACA基因突变位点双倍型与泌乳性状关联性分析

3 讨论

ACACA基因作为影响畜禽乳、肉品质性状及脂肪酸组成的重要候选基因，是脂肪酸从头合成的关键限速酶，在脂肪酸代谢过程中起到重要调控作用。本研究发现高原型牦牛ACACA基因5’UTR上存在2个SNP位点，分别为g.43478T>A和g.43569C>T，两个突变位点均处于Hardy Weinberg平衡状态，ACACA基因g.43478T>A处，TT型为优势基因型， g.43569C>T处CC型为优势基因型。将高原型牦牛的3个泌乳性状分别与ACACA基因突变位点的基因型进行关联分析发现，g.43478T>A位点上的AA基因型泌乳性状表现最优，乳脂率和乳蛋白率均极显著高于TT基因型(P<0.01)；g.43569C>T位点上的不同基因型的泌乳性状差异不显著(P>0.05)。对两个位点进行单倍型和连锁不平衡分析发现存在4种单倍型，但是2个SNP位点间不存在强的连锁性(r2=0.027)。进一步分析双倍型发现H2H2个体的乳脂率极显著高于其他类型双倍型(P<0.01)，不同双倍型之间乳蛋白率和乳糖率差异不显著(P>0.05)。因此，在本试验群体中，双倍型H2H2可被视为一种最为优秀的双倍型。在中国荷斯坦奶牛ACACA基因片段检测到g.43569T>C 和g.43617T>G 2个SNPs 位点，其显著影响中国荷斯坦奶牛的乳脂率，特别是H1H1(CG-CG)双倍型个体，其乳脂率显著高于其他双倍型个体[11]，该研究结果与本试验结果接近。甘南牦牛ACACA基因 PI和PIA 启动子区域位点突变影响乳脂率、乳蛋白率、乳脂肪酸含量、总固体物质含量及肌肉剪切力、熟肉率和失水率[12]。通过干扰奶牛PPARG基因后，ACACA基因表达水平和乳脂含量减少；过表达奶牛PPARG基因后，ACACA基因表达水平和乳脂随之升高[13]。绵羊ACACA基因启动子PIII 位点突变与乳脂含量呈显著相关性[9]，崂山奶山羊ACACA基因启动子PⅢ序列3个SNPs(第1206 位的B/D，1255 位的A/C 和1322 位的M/N)位点突变均对泌乳母羊的乳蛋白率、乳糖率、非脂肪物、乳密度、产奶量产生影响[14]。意大利当地山羊和萨能奶山羊ACACA基因PⅢ启动子位点突变与山羊乳脂率呈正相关[15]。

本研究结果表明，ACACA基因对高原型牦牛泌乳性状有一定的影响，可以作为标记辅助选择的候选基因，通过标记辅助选择和标记辅助导入技术指导牦牛的育种改良，缩短育种周期，对加快牦牛业的发展有重要的理论意义。