外周血hsa_circRNA_104600表达水平与急性缺血性脑卒中的关系研究▲
2021-06-07吴旭龙朱路路杨佳磊徐冰一赵直古联苏莉
吴旭龙 朱路路 杨佳磊 徐冰一 赵直 古联 苏莉*
1 广西医科大学公共卫生学院,南宁市 530021;2 广西中医药大学第一附属医院脑病科,南宁市 530023
缺血性脑卒中是由于脑动脉狭窄或闭塞、脑供血不足导致患者脑组织坏死的总称,约占全部脑卒中的85%;脑卒中是全球人群死亡的第二大疾病原因[1]。circRNA(Circular RNA,环形RNA分子)是一类不具有5′末端帽子和3′末端poly(A)尾巴,并以共价键形成环形结构的非编码RNA分子。哺乳动物的大脑中存在丰富的circRNA,参与调节机体许多病理生理过程,包括脑缺血损伤、神经发育和神经可塑性等[2]。发生脑缺血后,机体hsa_circRNA_104600的亲本基因VDAC3表达水平下降,使VDAC3蛋白水平保持稳定,有助于保护线粒体,改善机体神经功能[3]。本研究探讨了外周血hsa_circRNA_104600表达水平与急性缺血性脑卒中的关系,旨为探寻缺血性脑卒中的分子治疗靶点提供参考。
1 资料与方法
1.1 一般资料 选择2017年8月至2019年9月在广西中医药大学第一附属医院神经内科住院治疗的急性缺血性脑卒中患者45例作为病例组。纳入标准:符合1995 年中华医学会第四次全国脑血管病学术会议修订的《各类脑血管疾病诊断要点(1995)》[4]中的相关诊断标准,经头颅 CT和/或 MRI 检查确诊;发病在72 h以内;患者之间无血缘关系;患者或其家属签署检测研究知情同意书。排除标准:由短暂性脑缺血发作、动脉炎、脑外伤、肿瘤、血液病、脑血管畸形、药物等其他原因引起的缺血性脑卒中;合并严重心、肝、肾功能不全或造血功能障碍;合并严重免疫系统或感染性疾病。根据《美国国立卫生研究院卒中量表》(NIHSS)[5]评分,将纳入研究的患者分为轻度神经功能缺损组(<5分)、中重度神经功能缺损组(≥5分)。选择同期在南宁市青秀区2家社区卫生服务中心参加健康体检的健康志愿者45人为对照组。两组研究对象的性别、年龄比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。本研究经广西医科大学医学伦理委员会及广西中医药大学医学伦理委员会审查批准。
表1 两组研究对象的性别、年龄比较 (n,x±s)
1.2 方法
1.2.1 外周血circRNA表达水平检测 收集患者入院时和健康者体检时空腹静脉血5 mL储存于乙二胺四乙酸抗凝管,采用qRT-PCR技术检测hsa_circRNA_104600的表达水平。使用试剂:(1)TRIzol试剂(美国 Invitrogen公司);(2)PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser逆转录试剂盒[宝生物工程(大连)有限公司];(3)TB Green® Premix Ex TaqTMII[宝生物工程(大连)有限公司]。hsa_circRNA_104600和内参基因β-actin的引物序列见表2。
表2 hsa_circRNA_104600和β-actin的qRT-PCR引物序列
严格按照试剂说明书进行检测操作,运用TRIzol试剂提取研究对象外周血的RNA,用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser逆转录试剂盒,将总RNA逆转录成cDNA。采用StepOnePlus实时荧光定量PCR仪(美国ABI)、qRT-PCR技术检测hsa_circRNA_104600的表达水平。qRT-PCR反应条件如下:95℃ 30 s预变性;95℃ 5 s变性;60℃ 34 s退火、延伸40个循环,具体细节参照试剂说明书。
在qRT-PCR实验结束后导出数据,获得每个样本的CT值,单个样本的△CT=(该样本的hsa_circRNA_104600的平均CT值)-(该样本的β-actin的平均CT值),以2-△CT计算hsa_circRNA_104600的相对表达水平。
1.2.2 神经功能缺损严重程度评价 在患者入院后即对其神经功能缺损的严重程度进行评价。由经过统一培训的神经内科住院医师对患者进行NIHSS 量表评分[5],评分越高表示患者的神经功能缺损程度越严重。
1.3 观察指标 (1)比较病例组患者和对照组健康志愿者外周血hsa_circRNA_104600的表达水平;(2)绘制根据hsa_circRNA_104600水平诊断急性缺血性脑卒中的ROC曲线;(3)比较轻度神经功能缺损组与中重度神经功能缺损组患者外周血hsa_circRNA_104600表达水平。
1.4 统计学处理 采用R语言(R Version 3.6.3)统计学软件进行数据分析。计量资料以x±s表示,两组间均数的比较采用t检验;计数资料以%表示,比较采用χ2检验。绘制根据hsa_circRNA_104600水平诊断急性缺血性脑卒中的ROC曲线。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 病例组和对照组的外周血hsa_circRNA_104600表达水平比较 病例组急性缺血性脑卒中患者的外周血hsa_circRNA_104600表达水平显著高于对照组健康志愿者(W=587.500,P<0.05)。绘制ROC曲线,根据hsa_circRNA_104600外周血表达水平诊断急性缺血性脑卒中的ROC曲线下面积(AUC)为0.725、灵敏度为0.933、特异度为0.533。见图1、图2。
图1 病例组和对照组外周血 hsa_circRNA_104600表达水平比较
2.2 不同神经功能缺损严重程度患者的外周血hsa_circRNA_104600表达水平比较 中重度神经功能缺损组急性缺血性脑卒中患者的外周血hsa_circRNA_104600表达水平显著高于轻度神经功能缺损组患者,差异有统计学意义(W=129.407,P=0.049)。见图3。
图3 不同神经功能缺损严重程度患者的外周血hsa_circRNA_104600表达水平比较
3 讨 论
circRNA在人体中枢神经系统高度表达,在阿尔兹海默症、帕金森病和多发性硬化症等疾病发生发展过程中发挥着重要的作用[6]。Han等[7]报道,中动脉闭塞中风模型小鼠的大脑组织和缺血性脑卒中患者血浆中的circHectd1表达水平均显著升高,而敲除circHectd1可以缩小中动脉闭塞中风模型小鼠的梗死面积、减轻其神经元损伤。Bai等[8]报道,缺血性脑卒中患者血浆中的circDLGAP4表达水平显著降低;而circDLGAP4过表达可减轻脑卒中模型小鼠的神经功能缺损、减少梗死面积、减轻血脑屏障损伤。由此可见,circRNA可能在缺血性脑卒中的发生发展中发挥着重要的作用。Zuo等[9]通过检测200例急性缺血性脑卒中患者和100例健康对照者血浆中的circFUNDC1, circPDS5B和circCDC14A表达水平,绘制了根据这3个环状RNA分子联合诊断急性缺血性脑卒中的ROC曲线,结果发现AUC为0.875,诊断的灵敏度为0.715、特异度为0.910。因此认为,circFUNDC1, circPDS5B和circCDC14A表达水平可作为诊断急性缺血性脑卒中的生物学标志物。 本研究结果显示,根据hsa_circRNA_104600水平诊断急性缺血性脑卒中的AUC值为0.725,灵敏度为 0.933,特异度为0.533,与前述文献报道的结果相似。
hsa_circRNA_104600位于8号染色体42259305- 42260979上,其亲本基因VDAC3编码的蛋白属于线粒体孔蛋白家族,可能参与了腺嘌呤核苷酸的易位并导致细胞凋亡,而细胞凋亡可能是缺血性脑卒中后机体神经细胞死亡的重要原因[10-11]。近年研究发现,一些外周血非编码RNA的表达水平与急性缺血性脑卒中患者的NIHSS评分显著相关,NHISS评分常用于评估脑卒中患者病情的严重程度,由此可以推测患者外周血非编码RNA的表达水平可能对其病情的严重程度产生影响[12]。Chen等[13]报道,lncRNA HULC 与急性缺血性脑卒中患者的NHISS评分呈正相关关系(r=0.456),因此推测其可能结合miR-9后会抑制神经细胞的再生,从而增加患者脑卒中后的神经损伤。Peng等[14]报道,circRNA HECTD1和急性缺血性脑卒中患者NHISS评分呈正相关关系(r=0.462),推测其可能会竞争性结合miR-142,激活星形胶质细胞,扩大梗死面积,从而加重急性缺血性脑卒中患者的神经功能缺损程度。本研究结果显示,急性缺血性脑卒中患者的外周血hsa_circRNA_104600表达水平显著高于对照组健康志愿者,中重度神经功能缺损组患者的外周血hsa_circRNA_104600表达水平显著高于轻度神经功能缺损组患者。由此可以推测,hsa_circRNA_104600可能会通过竞争性结合miR-1246而导致机体大脑缺血再灌注损伤,从而加重急性缺血性脑卒中患者神经功能缺损。
综上所述,外周血hsa_circRNA_104600表达水平与急性缺血性脑卒中患者的发病及其神经功能缺损的严重程度存在比较密切的关系,可作为潜在的治疗靶点。