龙井茶多酚提取物对C57BL/6J小鼠肝脏氧化应激和代谢酶的影响

吕 乐，莫小叶，庞美霞，孙海燕*

1深圳职业技术学院博士后创新基地；2深圳职业技术学院 深圳市发酵精制检测系统重点实验室，深圳518055

肝脏是机体重要的解毒器官，参与调节机体内糖、脂肪、蛋白质的代谢，也是外源性物质代谢、转化的主要场所[1,2]。因此，病毒性肝炎、酒精性脂肪肝、肝纤维化、肝硬化和肝癌等肝脏机能的损伤会对机体产生严重的影响[3,4]。肝脏内含有大量的Ⅰ相、Ⅱ相药物代谢酶，及多种转运蛋白[5,6]。Ⅰ相药物代谢酶主要为CYP450酶系，负责氧化、还原、水解过程，可催化多种药物、毒物、前致癌物等外源性物质的代谢。Ⅱ相代谢酶主要包括尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(UDP-glucuronosyltransferase，UGT)、硫酸基转移酶(sulfotransferase，SULT)，催化Ⅰ相代谢酶产物与葡萄糖醛酸、硫酸、谷胱甘肽等共价结合，生成水溶性更好的产物，从而利于代谢产物的排除。ABC转运蛋白(ATP-binding cassette transporter，ABC)主要包括P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)、多耐药相关蛋白(multidrug resistance related proteins，MRPs)，他们属于同一家族，广泛存在于多种正常的组织和器官，参与药物、内/外源物质的吸收、分布、排泄，具有解毒和防御保护作用[7,8]。

茶叶制作过程大体包括杀青、发酵、捻揉和干燥4个步骤，根据其加工方法和发酵程度，分为白茶、黄茶、绿茶、黑茶、红茶、青茶。茶叶具有很好的抗氧化作用，在体内外都有抗自由基的活性[9]。茶叶中的生理活性物质主要为茶多酚，包括儿茶素类、花色苷、黄酮类等，也是茶叶抗氧化活性的主要物质基础[10,11]。绿茶是指未经发酵过的茶叶，龙井绿茶是我国四大名茶之首，素有“绿茶皇后”的美誉。有关绿茶有效成分生理功能的研究已经成为近年来的一个研究热点。

本团队前期研究表明龙井茶多酚提取物对小鼠肝脏内的CYP450有调节作用，但对Ⅱ相药物代谢酶和转运体的作用尚不明确。因此，本文在前期研究基础上，探讨龙井茶多酚提取物对C57BL/6J小鼠肝脏Ⅱ相代谢酶和转运体表达的影响，以及其对氧化应激的抵抗作用、以期为龙井茶多酚提取物的深度开发利用提供实验支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 茶叶

西湖龙井绿茶茶叶购自于深圳一品轩茶庄，粉碎，常温避光在干燥罐保存。

1.1.2 动物

购自于南方医科大学实验动物中心6～8周龄的SPF级雄性C57BL/6J小鼠[许可证号SCXK(粤)2016-0041]，体重20±2 g。

1.1.3 试剂与仪器

SOD、CAT、GSH、GSH-Px测试试剂盒(南京建成生物工程研究所)；MRP2、CYP2E1、CYP1A2、CYP3A4兔多克隆抗体、P-gp、UGT1A6、GAPDH兔单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔抗体(Abcam公司，USA)；SULT1A1兔多克隆抗体(Bioss公司)；Wes(Protein Simple，San Jose，USA)；显微镜(NIKON Eclipse ci，Japan)；成像系统(NIKON digital sight DS-FI2，Japan)。

1.2 龙井茶多酚提取物制备及含量测定

1.2.1 龙井茶多酚提取物的提取方法

龙井茶多酚提取物的提取参照国家标准(GBT8313-2018)并根据实验室条件稍作调整：取20 g过筛的龙井茶粉末，按1∶25(W/V)的比例加入70 ℃预热的70%甲醇，70 ℃水浴浸提30 min。浸提后，将体系冷却至室温，布氏漏斗抽滤，滤渣继续同法重复浸提2次。合并3次提取滤液，浓缩至原体积的15%～20%，确保甲醇几乎被除尽，浓缩液采用氯仿3∶1(V/V)萃取一次，分层后弃去氯仿层，采用旋转蒸发将水萃取层浓缩至原体积的5%，适量超纯水复溶。10 000 rpm，4 ℃离心15 min，上清液冷冻干燥后，常温避光干燥保存。以没食子酸为标准品，绘制标准曲线，采用Folin-Ciocalteu法测定龙井茶多酚提取物中总多酚的含量[12,13]。

1.2.2 动物实验及分组

40只C57BL/6J小鼠随机均等分为4组：对照组(control)、龙井茶多酚提取物37.5、75、150 mg/kg实验组。龙井茶多酚提取物实验组给予相应剂量的龙井茶多酚提取物，空白对照组给予生理盐水，灌胃体积均为0.1 mL/10 g·BW。各组连续灌胃6次，末次灌胃后8 h，摘眼球取血，分离小鼠肝脏。

苏佩斯的观点引发了更多学者对科学理论问题的关注，萨普、范·弗拉森和史纳德等人在其基础上进一步对经验科学的逻辑结构和模型结构加以探讨，形成了一种新的“公认观点”，从而促使对科学理论的理解得到了进一步的拓展。展开来说：

1.2.3 血清中ALT和AST含量测定

摘眼球取小鼠全血，4 ℃冰箱静置过夜，之后2 500 rpm，4 ℃，离心15 min，上层黄色液体即为血清。按说明书操作测定ALT、AST含量。

1.2.4 肝脏中GSH、GSH-Px、SOD、CAT测定

小鼠肝脏组织用4 ℃生理盐水清洗，滤纸擦干水渍后称质量，每只小鼠取50 mg左右组织，按1∶9的比例加入0.9%生理盐水，FastPrep-24匀浆。3 500 rpm，4 ℃离心10 min后取上清液得10%的肝脏组织匀浆。按说明书测定肝脏组织匀浆中GSH、GSH-Px、SOD、CAT含量。

1.2.5 病理切片

1.2.6 Western blotting蛋白分析

采用Western blotting法测定小鼠肝脏中CYP450，Ⅱ相代谢酶SULT1A1、UGT1A6和转运蛋白MRP2、P-gp的表达情况。称取在-80 ℃冻存的小鼠肝脏80 mg左右，加入冰上预冷的NP40裂解液1 mL，操作与冰上进行，用FastPrep-24匀浆，之后4 ℃，12 000 rpm离心30 min，分取上清液。BCA法测定蛋白浓度，将样品的蛋白浓度调整到5 mg/mL，按4∶1的体积比加入5×loading buffer，100 ℃加热5 min，冰上冷却，离心，混匀，分装，-80 ℃放置备用。另调整一份蛋白浓度为1 mg/mL的样品，-80 ℃放置备用。

取出-80 ℃冻存的制备好的5 mg/mL蛋白样品，100 ℃再次加热5 min。冰上冷却混匀。制胶、上样5 μL、电泳、转膜、封闭、一抗(GAPDH、CYP3A11、CYP1A2、CYP2E1、SULT1A1、P-gp)孵育、二抗孵育、显影成像。显影后将所得的蛋白质条带用Image Lab 5.1软件分析。

取出-80 ℃冻存的制备好的1 mg/mL蛋白样品，按照Simple Western兔抗检测剂盒说明书操作流程测定CYP3A11、CYP2E1、MRP2、UGT1A6的蛋白表达水平(详细条件见表1)。

表1 Western blotting一抗二抗列表Table 1 Description of primary and secondary antibodies for Western blotting

1.2.7 数据分析

数据采用mean±SD在图像上表示，采用SPSS 17.0软件进行统计分析，先进行方差齐性检验，若符合用单因素方差分析(ANOVA)，采用最小显著性差异法(LSD)检验，方差不齐者采用Tamhane’s T2检验，P<0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 龙井茶多酚提取物中多酚含量

没食子酸标准曲线为y=0.005 1x+0.041 5，r2=0.999 4，线性良好(见图1)。通过计算得龙井茶多酚提取物中总多酚的含量为494.93 mg/kg。

图1 没食子酸标准曲线Fig.1 Standard curve of garlic acid

2.2 病理切片

在每个实验组HE染色的病理切片挑选典型图片，通过分析，可以看出三个剂量的龙井茶多酚提取物对小鼠的肝脏不存在病理上的损伤(见图2)。

图2 小鼠肝脏病理学检查Fig.2 Pathologic changes of liver tissues of mouse

2.3 血清ALT和AST含量

龙井茶多酚提取物对小鼠肝脏中ALT、AST的影响情况见图3。相对于空白组，75 mg/kg的龙井茶多酚提取物能显著性降低小鼠血清中ALT的水平，150 mg/kg的龙井茶多酚提取物能显著性增加血清中AST的水平，其他剂量组没有显著性差异。

图3 小鼠肝脏ALT和AST水平Fig.3 AST and ALT level in mouse liver注：与空白对照组比较，*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001；下同。Note:Compared with control,*P < 0.05,** P < 0.01,***P < 0.001;The same below.

2.4 肝脏组织中GSH、GSH-Px、SOD和CAT含量

龙井茶多酚提取物对小鼠肝脏中生化指标的影响见图4。对于GSH，相对于对照组，三个剂量的龙井茶多酚提取物显著性降低了肝脏内的GSH水平，与剂量呈负相关(见图4A)。对于GSH-Px，相对于对照组，三个剂量的龙井茶多酚提取物就能显著性提高小鼠肝脏中GSH-Px的含量(见图4B)。对于SOD，相对于对照组，龙井茶多酚提取物对其在肝脏中的含量没有显著性影响(见图4C)。对于CAT，相对于对照组，37.5 mg/kg龙井茶多酚提取物能够显著性提高其在小鼠肝脏中的含量，但是75和150 mg/kg的剂量显著性降低其在肝脏中的活性(见图4D)。

图4 肝脏组织中生物化学指标含量Fig.4 Biochemistry makers content in liver tissue

2.5 龙井茶多酚提取物对CYP450的影响

龙井茶多酚提取物对CYP450的影响见图5。对于CYP1A2，相对于对照组，三个剂量的龙井茶多酚提取物对小鼠肝脏中CYP1A2相对蛋白表达水平没有显著性影响(见图5A)；对于CYP2E1，相对于对照组，37.5和75 mg/kg龙井茶多酚提取物可以显著性上调CYP2E1的蛋白表达水平，150 mg/kg龙井茶多酚提取物对该蛋白的相对表达水平没有影响(见图5B)。对于CYP3A11，相对于对照组，37.5 mg/kg龙井茶多酚提取物可以显著性上调CYP3A11的蛋白表达水平(见图5C)，75 mg/kg龙井茶多酚提取物对小鼠肝脏中CYP3A11相对蛋白表达水平没有显著性影响，150 mg/kg龙井茶多酚提取物显著性抑制CYP3A11的蛋白表达水平(见图5C)。

图5 小鼠肝脏中CYP450的相对蛋白表达水平Fig.5 Relative protein expression of CYP450 in mouse liver

2.6 龙井茶多酚提取物对Ⅱ相代谢酶的影响

龙井茶多酚提取物对Ⅱ相代谢酶的影响见图6。对于SULT1A1，相对于对照组，对于37.5 mg/kg龙井茶多酚提取物能够显著性提高SULT1A1的相对蛋白表达水平，75和150 mg/kg龙井茶多酚提取物对该酶的蛋白表达水平没有显著性影响。对于UGT1A6，相对于对照组，37.5 mg/kg龙井茶多酚提取物能显著性提高小鼠肝脏中UGT1A6的相对蛋白表达水平，75.5和150 mg/kg的剂量对该蛋白的表达水平没有显著性影响。

图6 小鼠肝脏中Ⅱ相代谢酶的相对蛋白表达水平Fig.6 Relative protein expression of phase Ⅱ enzymes in mouse liver

2.7 龙井茶多酚提取物对转运蛋白的影响

龙井茶多酚对小鼠肝脏中转运蛋白的影响见图7。对于MRP2，相对于对照组，75和150 mg/kg龙井茶多酚提取物可以显著性提高其蛋白表达水平(见图7A)。对于P-gp，相对于对照组，37.5和150 mg/kg龙井茶多酚提取物均显著性抑制P-gp的蛋白相对表达水平，75 mg/kg龙井茶多酚提取物对P-gp的蛋白表达水平没有显著性影响(见图7B)。

图7 小鼠肝脏中转运蛋白的相对蛋白表达水平Fig.7 Relative protein expression of transporters in mouse liver

3 讨论与结论

ALT和AST是衡量肝脏功能是否发生异常的两个重要指标。通常情况下，ALT和AST主要存在于肝脏中，在血液中的含量极低。但是当肝脏功能发生异常时，ALT和AST就会从肝脏中转移至血液中，导致血液中ALT、AST含量升高，活性增加。从血清中ALT、AST的活性变化情况，可以知道肝脏的健康情况。本实验结果显示，相对于空白组，75 mg/kg的龙井茶多酚提取物能显著性降低小鼠血清中ALT的水平，150 mg/kg的龙井茶多酚提取物能显著性增加血清中AST的水平，其他剂量组没有显著性差异。但是在临床上，在ALT正常的情况下，单纯的AST升高并不能说明肝脏存在损伤，同时病理切片结果分析显示龙井茶多酚对小鼠肝脏不存在病理上的伤害。

人体细胞、组织受到氧化胁迫是癌症、心血管疾病等诸多疾病的诱因之一[14,15]。为保护机体免受过氧化的损伤，细胞有一套完善的抗氧化酶防御酶系。主要包括SOD、CAT、GSH、GSH-Px等。其中SOD把超氧阴离子转换为H2O2，GSH-Px和CAT将H2O2催化成H2O，从而将毒性超氧阴离子和H2O2转换成无毒的H2O[16]。茶多酚是一种优良的天然抗氧化剂，富含-OH基团，具有很好的体内外抗氧化活性，对氧化应激具有较强的调节作用。龙井茶多酚提取物对小鼠肝脏内SOD活性没有显著性影响，但是可以显著性增加GSH-Px的活性，37.5 mg/kg龙井茶多酚提取物可以显著性增加CAT在肝脏中的活性。可以看出龙井茶多酚提取物能通过调节CAT和GSH-Px在小鼠肝脏中的含量来增加小鼠肝脏抵抗氧化应激能力。对于GSH，随着龙井茶多酚提取物给予的剂量的增加，其肝脏内的含量下降，可能是由于龙井茶多酚作为提取物，其中的其他成分造成了GSH的消耗。

CYP450参与内/外源性物质的代谢，包括药物、环境化合物等，具有个体差异大，容易受到外源性物质的影响的特点[17]。37.5 mg/kg龙井茶多酚提取物能显著性提高CYP2E1/3A11两个亚型在小鼠肝脏中的蛋白表达水平。说明低剂量的龙井茶多酚提取物对CYP450有一定的诱导作用。Ⅱ相代谢酶UGTs和SULTs主要分布在肝脏，将内/外源性物质代谢为易于排出的水溶性物质[18]。37.5 mg/kg的龙井茶多酚提取物可以显著性增加UGT1A6和SULT1A1在小鼠肝脏中的蛋白表达水平，而75和150 mg/kg龙井茶多酚提取物对这两个酶的表达情况没有显著性影响。说明低剂量的龙井茶多酚提取物对Ⅱ相代谢酶有一定的诱导作用。MRP2主要分布在人体肝细胞基底膜上，它能在阻塞性黄疸中调节肝细胞的损伤，参与细胞内外多种毒性复合物的转运、调整细胞内物质的重分布、促进胆汁的分泌，增加胆汁酸盐的脂溶性。75和150 mg/kg的龙井茶多酚提取物可以显著性提高小鼠肝脏内MRP2的蛋白表达水平，有潜在的保护肝细胞的作用。P-gp是一个比较常见的保护细胞免受外来有害分子入侵的分子泵，它位于细胞膜上，能与药物结合，同时具有ATP酶活性，能够分解ATP供能，将细胞内药物泵出细胞外，减低细胞内的药物浓度使细胞产生耐药性[19]。37.5和150 mg/kg的龙井茶多酚提取物对P-gp的蛋白表达水平呈现下调作用，75 mg/kg的龙井茶多酚提取物对P-gp的蛋白表达水平没有显著性影响，这可能是由于龙井茶多酚的代谢产物或者其本身会经P-gp排出。黄希希等人的综述确定茶多酚中EGCG和药物代谢酶和转运体之间存在相互作用，其具体作用机制有待进一步确认。

通过本研究可以看出，龙井茶多酚能够加强小鼠肝脏内的氧化防御系统功能，帮助机体抵御内/外源性氧化应激。低剂量的龙井茶多酚对小鼠肝脏内的Ⅰ相代谢酶、Ⅱ相代谢酶和转运蛋白都有一定的诱导作用。抗氧化酶系、Ⅱ相代谢酶和转运蛋白的调节涉及Nrf2-Keap1通路[20,21]。而CYP450酶系受雄烷受体(CAR)和孕烷X受体(PXR)的调节，龙井茶多酚对这些可能涉及的通路的影响值得更深入的研究[22,23]。