RhD抗原初检阴性供血者及患者Del检测的临床意义

宋倩，郝一文

（中国医科大学附属第一医院输血科，沈阳 110001）

目前，我国临床红细胞输血一般要求RhD同型，以避免发生D抗原不同导致的免疫问题。RhD阴性比例极低，是大众熟知的“熊猫血型”。RhD基因具有丰富多态性，我国中部地区初检RhD阴性者中约20%～30%为Del型，即极弱D或放散D［1-5］。Del型自身存在D抗原，Del型受血者或孕妇输血时不会被D抗原致敏而产生D抗体［6-7］，因此不必输注RhD阴性血而浪费RhD阴性血资源；而Del型供者则可能因携带的少量D抗原使RhD阴性者产生免疫反应，使RhD阴性者产生抗D抗体而使后续输血困难。因此，对RhD阴性患者、孕妇及供者进行Del筛查具有重要意义。本研究对我科室2018年9月至2019年8月间112例初检RhD阴性者进行Del筛查，探讨Del检测的临床意义。

1 材料与方法

1.1 临床资料

收集2018年9月至2019年8月中国医科大学附属第一医院输血科接收的初检RhD阴性标本112例，其中内科输血17例，外科手术备血31例，产科住院者产前备自体血9例，门诊孕妇产前抗体效价检测6例，供血者49例（血液规格2 U/例）。

1.2 试剂及仪器设备

单克隆抗D（IgM+IgG）购自长春博德生物技术有限责任公司，单克隆抗D（IgG）定型血清购自上海血液生物医药有限公司。ABO-CDE血型定型卡及Coombs微柱凝胶卡购自西班牙Diana公司。单克隆抗c、抗e血型定型试剂，抗人球蛋白试剂和不规则抗体筛查细胞购自上海血液生物医药有限公司。O型RhD阳性压积红细胞由本实验室配制并当日使用。

1.3 方法

1.3.1 常规Rh血型检测：采用ABO-CDE微柱凝胶定型卡检测患者血标本ABO-CDE血型表型；采用盐水法IgM型抗c、抗e检测c、e表型，具体步骤均按照说明书进行操作。

1.3.2 直接抗人球蛋白试验（direct antiglobulin test，DAT）：为排除红细胞直抗阳性对检测结果的干扰，每例红细胞标本均进行DAT。具体方法按说明书操作。

1.3.3 Del型检测：利用3批次不同细胞株来源的抗D对初筛RhD抗原阴性、直抗阴性标本进行试管法间接抗人球蛋白试验（indirect antiglobulin test，IAT），排除弱D后进行吸收放散实验：（1）将待测压积红细胞和O型RhD阳性红细胞分别与单克隆抗D（IgM+IgG）1 ∶1混匀，各实验管均置37 ℃孵育30 min；（2）生理盐水反复洗涤，直至取末次洗涤液与5% O型RhD阳性细胞IAT反应阴性；（3）加入等体积生理盐水，置56 ℃放散10 min，离心1 min；（4）取放散液100 μL加入5%的O型RhD阳性红细胞悬液50 μL，37 ℃孵育30 min；（5）洗涤3次，加抗人球蛋白试剂，离心15 s，肉眼或显微镜下观察结果。

1.3.4 临床输血不良反应及输血相关免疫性抗体发生情况监测：查阅48例受血者（内科输血17例，外科手术备血31例）输血记录和住院病志，并在患者输血后1～7 d抽取1次静脉血进行卡式不规则抗体筛查，具体步骤按说明书进行操作。本研究取得受血者知情同意并签署知情同意书。

2 结果

2.1 初检RhD阴性者DAT、IAT及Del型分布结果

结果显示，112例初检RhD阴性者DAT和IAT均阴性。初检RhD阴性者Del型分布见表1。

表1 112例初检RhD阴性者Del型分布

2.2 初检RhD阴性者的RhCE表型分布

结果显示，35例Del型中，RhCE表型Ccee19例、CCee 11例、CcEe 2例、CCEe1例、ccEe2例，见表2。

表2 RhCE表型分布 ［n（%）］

2.3 孕妇临床处置

9例Rh阴性住院自体贮血孕妇中4例（含1例Del型）各采集1次全血（400 mL），5例（含3例Del型）各采集2次全血（共800 mL），在分娩中和分娩后均未回输，血液过期报废处理。6例门诊Rh阴性孕妇（含2例Del型）孕24～32周时进行2次或3次产前抗体效价检测，均未检出Rh系统抗体，其中1例Del型孕妇预防注射了抗D免疫球蛋白。

2.4 初筛RhD阴性受血者血液供应、输血不良反应及相关免疫性抗体发生情况

结果显示，48例RhD阴性受血者（内科输血17例，外科手术备血31例）从提交输血申请单到RhD阴性血液送达医院输血科时间为0.5～3 d，平均1.2 d。其中4例外科手术备血、1例内科输血患者因RhD阴性血存量有限降低了申请剂量。

12例RhD真阴性患者（内科11例，外科1例）输注了Del型血，其中1例内科患者接受了2次Del型红细胞（4 U），其余受血者均接受1次Del型红细胞（2 U）。受血者输血情况见表3。另外，外科中19例患者（含6例Del型，13例真阴性）手术过程失血量少、无乏氧状态，故未输血。48例RhD阴性受血者均未见输血不良反应，均未产生抗D抗体。

表3 48例RhD阴性受血者输血情况

3 讨论

Del型在欧洲、美洲及南亚地区少见，RhD阴性人群中概率＜1%［8-10］，但在东亚地区RhD阴性人群中常见（9.1%～26.9%）［11-13］。我国Del表型常由RhD等位基因突变引起，RhD基因的第9外显子1 227位发生G＞A碱基突变，此等位基因碱基突变为无义突变，但是影响mRNA正常拼接，使RhD基因表达正常Rh（D）蛋白的效率降低［6，14］。正常RhD抗原阳性红细胞表面约有10 000～30 000个抗原表位，而Del型红细胞膜上D抗原非常弱，表位数量可能＜30个［15］，只有通过吸收放散试验才能检测出来。庄乃保等［7］通过Del型与RhD蛋白质三维结构比较，发现Del型膜外部分与正常RhD蛋白基本一致，即Del血型完全或基本具有正常RhD的抗原表位。因此，在输血相容性检测中确认RhD阴性供血者时排除Del型对确保输血安全非常重要，同时，Del受血者则无需等待RhD阴性血液，有助于提高诊疗效率，节约稀有血型的血液资源。

本研究中112例初检RhD阴性标本中Del型35例（31.3%），与西安（19.7%）［3］、武汉（24.2%）［4］、合肥（27.2%）［5］比较概率较高。孕妇中RhD阴性者是孕期产生RhD抗体的高风险群体。吴筱莹等［16］研究发现，196例初检阴性孕妇中，Del型占20.9%，去除Del型样本重新统计，有生育史的RhD真阴性孕妇发生D抗原同种免疫反应者接近50%；研究还发现Del型孕妇不因妊娠和生育产生抗D抗体。本研究中2例（33.3%）Del型孕妇在门诊期间接受了包括产前不规则抗体筛查及产前RhD抗体效价测定、RhD免疫球蛋白预防应用等处置。4例（44.4%）Del型孕妇在孕晚期采集了400～800 mL自体血。可见，未进行Del检测使Del型孕妇承担更多的医疗负担，而RhD真阴性孕妇胎儿溶血发生概率被低估。

有研究［17］报道Del供血输注给RhD阴性患者产生抗D抗体。本研究中献血者15例Del型供者中13例输注给了真阴性患者。12例受血者中有1例接受了2次Del型红细胞（4 U），11例接受1次Del型红细胞（2 U），所有患者住院期间均无输血反应报告（受血者输血前均未检出不规则抗体），对受血者不规则抗体监测时间最长1周，血清中均未检出抗D抗体，这可能与患者输血量和输血次数有关。Del细胞表面D抗原数量较D阳性细胞少，患者初次抗原免疫刺激后机体约60～90 d后产生抗体，初次免疫产生抗体后再次被相应抗原刺激免疫记忆反应的抗体效价在2～3周达到峰值。另外，我国RhD阴性者基因结构有完全缺失、部分缺失和不缺失3种，RhD基因不缺失者输入Del红细胞不会产生抗D抗体［17］。

有研究［18］表明Del型与RhCE表型相关，Del型中100%RhC（+）。本研究35例Del型中RhCE表型为Ccee19例、CCee11例、CcEe 2例、CCEe1例、ccEe 2例，RhC阳性较多（94.3%），但仍有2例为RhC阴性，说明临床应用中根据CE表型直接排除Del型不可行。研究［2，13］显示，随着更多Del相关等位基因被发现，其对应的血清学表型不具唯一性。另外，吸收放散试验存在一定缺陷：（1）操作过程繁琐费时，人员操作误差较大；（2）Del型红细胞表面存在抗原量极少，反应强度弱容易被忽略而漏检。

综上所述，初检RhD阴性人中Del型比例较高，应对初检RhD阴性者进行Del型检测，避免RhD阴性患者输注Del血液而产生抗D抗体；如果患者为Del型，可以选择RhD阳性血液输注，既能保证输血的及时性，又能节约宝贵的RhD阴性血液资源。仅凭RhCE表型不能排除Del型，血清学联合分子生物学方法有利于检测标准化，提高检测准确度［12，19］。