基于电子舌快速检测冷藏双斑东方鲀的新鲜度

贾哲，陈晓婷，潘南，蔡水淋，张怡，刘智禹

（1.福建农林大学食品科学学院，福建福州 350000）（2.福建省水产研究所国家海水鱼类加工技术研发分中心（厦门）福建省海洋生物增养殖与高值化利用重点实验室，福建厦门 361000）

双斑东方鲀（Fugu bimaculatus），是我国福建省东方鲀的养殖种类之一，新鲜的养殖双斑东方鲀滋味鲜美、风味独特，但因其含有丰富的水分、蛋白质和不饱和脂肪酸，在贮藏加工过程中极易氧化变质，从而导致其特有的滋味逐渐变差。目前，鱼类鲜度检验的方法主要有感官评价、菌落总数、理化指标检测（如K值、总挥发性盐基氮等）等，其中感官评价较为快速、简便，但易受主观因素的影响，具有一定的局限性，理化指标能准确反映鱼体的鲜度但对检测人员专业要求高，且操作繁琐、耗时较长，难以实现实时检测[1-4]，因此，探究一种快速又准确的冷藏双斑东方鲀新鲜度评价体系具有重要意义。

电子舌（Electronic Tongue，ET）是一种利用多传感阵列测量未知样品的特征响应信号，通过信号模式识别及专家系统学习识别，对样品进行定性或定量分析的新型现代化分析检测仪器[5,6]。电子舌因其具有快速准确、操作简单等优点而被广泛应用；韩剑众[7]等人发现电子舌不仅可以有效区分淡水鱼（鲈鱼、鳙鱼、鲫鱼）和海水鱼（马鲇鱼、小黄鱼、鲳鱼）还能较准确地表征其新鲜度的变化；韩方凯[8]等利用电子舌技术对4 ℃下不同冷藏天数的鲳鱼进行检测，并构建了K最近邻判别模型和BP人工神经网络模型来评价鲳鱼新鲜度。以上研究结果表明利用电子舌技术判别鱼类新鲜度具有可行性，但将电子舌技术应用于不同冷藏期双斑东方鲀新鲜度的评价，并构建预测模型的研究鲜见报道。

因此，本文以新鲜双斑东方鲀为研究对象，通过研究其在冷藏过程中的TVC、游离氨基酸、ATP及其关联物、以及鱼肉滋味轮廓的变化规律，建立双斑东方鲀新鲜度鉴别模型，并探讨电子舌技术用于快速评定不同冷藏期的双斑东方鲀新鲜度的可能性。以期为电子舌技术在水产品鲜度评价中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

鲜活双斑东方鲀购于福建省漳州市漳浦县佛昙镇，重约200±50 g。

ATP标准品，美国Sigma公司；氨基酸，混标和光纯药工业株式会社；甲醇，ASC；盐酸，莱阳市康德化工有限公司；菌落总数测试片，绿洲生化；其他试剂均为国产AR级。

1.1.2 主要仪器设备

电子天平赛多利斯科学仪器北京有限公司；HWS-28型电热恒温水浴锅，一恒科学仪器有限公司；5804R离心机，艾本德中国有限公司；Waters e2695高效液相色谱仪，美国 Waters ACQUITY H-CLASS/TUV；TS-5000Z型电子舌系统，日本Insent公司；LA8080氨基酸自动分析仪，日本株式会社日立高新技术科学。

1.2 试验方法

1.2.1 原料处理

双斑东方鲀处理方法参考SC/T 3033-2016《养殖暗纹东方鲜、冻品加工操作规范》[9]并略作修改。鲜活双斑东方鲀，剖腹、去腮、去内脏后，清洗沥干后装入自封袋后，于4 ℃和0 ℃冰箱保存，隔天进行各项指标的测定分析。

1.2.2 菌落总数的测定

参考GB 4789.2-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》[10]进行测定，称取鱼肉25 g，用无菌剪刀剪碎，加入225 mL生理盐水中，均质1 min后制成1:10的悬浊液，选择合适的稀释梯度，涂布于菌落总数测试片，于30±2 ℃培养箱中培养48 h。

1.2.3 游离氨基酸的测定

将整条鱼鱼肉搅碎后称取20 g样品于离心管中，加入0.02 mol/L盐酸定容。净化：分别加入5 mL甲醇，5 mL水，对C18前处理小柱进行活化，加入2.5 mL样品，再加1.5 mL 0.02 mol/L盐酸，过柱后的样品用0.02 mol/L盐酸定容到5 mL，过0.45 μm滤膜后上机。

色谱柱：磺酸型阳离子树脂分离柱，波长：570 nm和440 nm，进样量：20 μL，反应温度：135±5 ℃。

1.2.4 ATP及其关联物的测定

将整条鱼鱼肉搅碎后称取5.00 g碎鱼肉加入20 mL 10%的高氯酸，涡旋振荡1 min，4 ℃、8000 r/min离心10 min，取上清液，加5 mL 5%高氯酸溶液提取沉淀物中的待测物，合并上清液，用氢氧化钠溶液调pH至4.0～4.2，4 ℃超纯水定容至50 mL，0.22 μm微孔滤膜过滤，4 ℃下保存待测。

1.2.5 电子舌测定

将整条鱼鱼肉搅碎后取25 g碎鱼肉加50 mL去离子水，涡旋振荡30 s，煮沸30 min，冷却后过滤，滤液于4 ℃下8000 r/min离心10 min，取适量上清液进行分析测定。

1.6 数据分析与模型构建

应用SPSS 22.0、Unscrambler 10.4和Origin 9.5对电子舌传感器响应值和TVC进行分析、绘图，并建立偏最小二乘法（PLSR）和多元线性回归（MLR）预测模型，以训练集和预测集的相关系数（RC和RP）、均方根误差（RΜSEP）作为评价模型优劣的指标，然后将测试集代入模型，预测样本的TVC，并根据双斑东方鲀鲜度等级的评价结果来判断该的准确性。

1.7 数据分析

理化和电子舌信息数据均使用SPSS 22.0进行差异性显著分析（t检验）统计分析和Pearson相关性分析，PCA和相关性分析均由SPSS 22.0完成，PLS和MLR分析均由Unscrambler version 10.4软件完成，并由Origin 9.5和TBtools 0.665软件进行绘图，Excel绘制表格。

2 结果与讨论

2.1 菌落总数的测定

图1 双斑东方鲀冷藏过程中菌落总数的变化Fig.1 Changes in the TVC value of Fugu bimaculatusas during chilled storage

冷藏过程中河鲀鱼肉菌落总数（TVC）的变化如图1所示，在0 ℃和4 ℃贮藏1 d后河鲀鱼皮的TVC值分别为1.05、1.13 lg(CFU/g)，随着贮藏时间的增加，两组的TVC值均逐渐上升，其中4 ℃冷藏条件下菌落总数的增加速率显著（p<0.05）大于0 ℃贮藏组。参考无公害水产品TVC值可接受上限要求6 lg(CFU/g)[11]，将双斑东方鲀新鲜度划分为新鲜0～2 lg(CFU/g)、较新鲜2～6 lg（CFU/g）、和腐败≥6 lg(CFU/g)三类，在0 ℃条件下，双斑东方鲀鱼肉1 d为新鲜状态；2～5 d为较新鲜，仍可食用；7 d开始进入腐败阶段。4 ℃冷藏组于5 d开始进入腐败阶段，由此判断双斑东方鲀鱼肉在0 ℃和4 ℃条件下的货架期分别为5 d和7 d。刘欣荣[12]发现4 ℃冷藏过程中红鳍东方鲀的最佳食用期为1～5 d，其中TVC呈上升趋势，于第5 d高出水产品国家标准规定的可食用界限5.0 lg(CFU/g)，与本文的研究结果相似。

2.2 游离氨基酸含量的变化

图2 双斑东方鲀冷藏过程中游离氨基酸含量变化热图Fig.2 Heat map of changes in the free amino acids contents of Fugu bimaculatus during chilled storage

图3 双斑东方鲀冷藏过程中游离氨基酸含量变化Fig.3 Changes in the free amino acids contents of Fugu bimaculatus during chilled storage

游离氨基酸（FAA）是鱼肉中非蛋白氮、滋味物质和风味前体物质的重要组成部分[13,14]，其含量、种类及各种氨基酸之间的相对平衡与鱼肉的滋味密切相关[15]，具有酸、甜、苦、鲜等味道，但因鲜活水产品的肌肉组织呈微碱性，无法察觉到酸味，故一般分为鲜、甜和苦3类[16]。由图2和图3可知，新鲜双斑东方鲀肌肉中游离氨基酸不仅含量高，种类也较多，一共有17种氨基酸，总游离氨基酸含量（TAA）约为14.88 mg/kg，必需氨基酸（EAA）约为6.86 mg/kg；其中甜味氨基酸含量（SAA）较高，约为9.47 mg/kg，其次为苦味氨基酸（BAA）＞鲜味氨基酸（FAA），有研究表明甜味是水产食品的一个主要特征味道，不仅能产生令人愉快的风味还可以减轻苦味[17,18]。鱼肉中赖氨酸（Lys）、丙氨酸（Ala）、精氨酸（Arg）和甘氨酸（Gly）的含量较高，分别占总游离氨基酸的26.56%、17.93%、12.10%和7.20%，Gly、Ala属于鲜味氨基酸(DAA)，Gly和Ala是甜味的特征氨基酸[19]，Arg具有增加呈味复杂性和提高鲜度的作用[20]，Lys可以提高人体对其他营养物质的吸收利[21]，郭芮等发现红鳍东方鲀鱼肉中也含有丰富的Lys[22]；0 ℃和4 ℃条件下冷藏5 d后，TAA、FAA、SAA、EAA含量下降，BAA上升，Ala和Arg含量增加，Lys和Gly含量减少，其中4 ℃组的变化幅度略大于0 ℃组；随着冷藏时间的延长，Ala和Lys含量增加，Arg和Gly含量逐渐下降，冷藏11d后，FAA含量下降，约占TAA的2.32%和0.91%，BAA含量持续上升，说明FAA含量的减少和BAA的增加可能是贮藏后期鱼肉口感风味下降的重要原因之一，且0 ℃组贮藏有利于减缓鱼肉中氨基酸的变化，较好的保持鱼肉滋味和品质，与陈燕婷[23]等研究结果相似。

2.3 呈味氨基酸分析

图4 双斑东方鲀冷藏过程中游离氨基酸含量变化Fig.4 Changes in the free flavor amino acidcontents of Fugu bimaculatus during

鱼肉滋味的鲜美程度与游离氨基酸的含量和组成密切相关[24]，由于其含量在冷藏过程中发生较大变化，且不同氨基酸的阈值存在差异，故仅凭游离氨基酸含量的变化并不能准确分析鱼肉在冷藏过程中氨基酸的变化与其滋味之间的关系，因此使用TAV值对其进行分析。TAV值指游离氨基酸对滋味的贡献度，当其大于1时，表示该氨基酸对样品滋味有贡献，小于1则没有贡献[25-27]。由图4可知，鲜鱼整体滋味的贡献较大的氨基酸为：Lys＞Ala＞Arg＞Val＞Glu＞Met，Glu是鲜味氨基酸，Lys是既有苦味，又有甜味的氨基酸，Ala为甜味氨基酸，Val、Met和Arg是苦味氨基酸，其中Arg只在浓高度时呈苦味，在较低浓度时其本身的苦味可被其他成分掩盖并转变成风味增强剂[28]。冷藏中期，0 ℃组和4 ℃组鱼肉滋味的主要贡献物质分别是Lys＞Ala＞Arg＞Glu＞Val和Lys＞Ala＞Arg＞Val；随着冷藏时间的延长，两组样品中Glu的含量逐渐下降且小于其阈值；Val和Arg含量虽然较小但仍大于其阈值，Ala、Lys和Met逐渐增加，且4 ℃组显著大于0 ℃组（p＜0.05）；冷藏末期，Lys＞Ala＞Arg＞Val＞Met和Lys=Ala＞Arg＞Val＞His（苦味）＞Met分别为0 ℃组和4 ℃组鱼肉主要呈味物质，说明鱼肉在冷藏过程中鲜甜味逐渐下降，苦味逐渐增加，鱼肉风味逐渐变差。

2.4 双斑东方鲀冷藏过程中ATP及其关联物的变化

图5 双斑东方鲀冷藏过程中ATP关联化合物的变化Fig.5 Changes in levels of ATP and related compounds in Fugu bimaculatus during refrigerated storage

三磷酸腺苷（ATP）及其关联物是核苷酸的重要组成部分[29]，也是影响鱼类风味的重要的物质之一。鱼类死后其体内的ATP依次降解为ADP、AMP、IMP、HxR、Hx，其中IMP是重要的鲜味物质[30]，与谷氨酸共存时具有鲜味增效的作用，同时IMP对咸味、酸味、苦味及腥味有抑制作用，即有味觉缓冲作用[31,32]，当IMP发生降解时，会生成具有苦味、涩味的Hx和HxR。有研究认为GMP具有鲜味，其味道强度约是IMP的2.3倍[33]，Fuke等人发现AMP与IMP也具有协同增鲜作用[34]。

由图5可知，贮藏1 d时，两组（4 ℃和0 ℃）样品中IMP含量最高，分别为79.37 μmol/g和92.88 μmol/g，约占总量的63.91%和55.42%。在冷藏过程中，两组鱼肉中IMP先增加后减少，与Zhan[35]等研究结果一致；HxR和Hx含量不断增加；AMP先增加后减少，这一结果与付奥[36]等人对冷藏草鱼AMP含量变化规律的研究结果一致；ATP含量与贮藏时间呈负相关性，始终呈下降趋势，其中，4 ℃组ATP及其关联物含量的变化幅度较0 ℃组大。以上结果说明，鱼肉在冷藏过程中ATP发生了降解，虽然ATP在降解同时也存在Adr途径，但HxR和Hx含量逐渐增加，表明双斑东方鲀的鲜度开始下降[37]。

鱼肉中ATP含量不断降低，可能与ATP的合成速率以及ATP酶的活性有关。IMP含量和AMP在3d上升至最大值，随后不断降低，这说明在贮藏的前3 d，ATP通过ADP、AMP降解为IMP的速率大于IMP降解为HxR的速率，随着贮藏时间的增加，IMP磷酸水解酶活性和微生物数量逐渐增加，IMP降解速率逐渐大于ATP降解速率，从而导致IMP含量降低，HxR和Hx含量不断增加[38]。有研究表明HxR降解所需的核苷酸磷酸化酶主要来自细菌，随着贮藏时间的延长，鱼肉中微生物不断增加，该酶的积累量逐渐上升，从而加快了Hx的上升速率[39,40]。在贮藏过程中，0 ℃组Hx含量较4 ℃组低，HxR含量高于4 ℃组，这可能与0 ℃的温度更低，对微生物的抑制力更强有关。

2.5 电子舌响应值分析

双斑东方鲀在4 ℃和0 ℃贮藏期间电子舌对鱼肉味觉响应值测定结果如图6所示。由图可知，在整个冷藏过程中，0 ℃组和4 ℃组8个传感器的响应轮廓大致相似，但响应值存在较大差异，说明不同传感器对不同贮藏时期的鱼肉的敏感度不同。贮藏1 d，两组鱼肉鲜味的响应信号值最高且高于无味点（无味点即参比溶液的味觉值，一般设为零点），这表明贮藏初期双斑东方鲀主要呈鲜味，随着冷藏时间的增加，鱼肉的鲜味下降，苦味和酸味增加，鱼肉滋味逐渐变差。

如图7所示，4 ℃和0 ℃组贮藏过程中鲜味的信号强度总体呈下降趋势，贮藏11 d后，分别下降了61.98%和48.53%，酸味的信号强度显著性增加，由贮藏初期的-2.73和-3.15增加至18.43和15.52，苦味呈现微弱的上升趋势，由-1.99、-1.48上升至2.16和1.18，这表明双斑东方鲀贮藏后期主要呈酸味和苦味，且鲜味、苦味信号强度的变化这与鲜味氨基酸和苦味氨基酸的变化趋势一致。有研究表明，水产品中的鲜味物质主要包括谷氨酸单钠、天冬氨酸单钠、5’-单磷酸鸟苷二钠（GMP）和5’-单磷酸腺苷二钠（AMP）和某些小肽等物质[41]，双斑东方鲀在冷藏过程中，天冬氨酸、谷氨酸和AMP均显著性降低（p<0.05），这说明鱼肉贮藏过程中鲜味受氨基酸和呈味核苷酸含量变化的影响。新鲜的水产品通常没有苦味[41]，贮藏后期鱼肉苦味的上升可能与亮氨酸、组氨酸、丙氨酸等苦味氨基酸以及具有苦味的Hx的增加有关，酸味的增加可能与组氨酸等的增加有关。

图6 双斑东方鲀冷藏过程中的电子舌响应雷达图Fig.6 Electronic tongue response radar maps duringh cold storage of Fugu bimaculatus

图7 双斑东方鲀冷藏期间滋味指标单因素方差分析Fig.7 ANOVA for taste indicators of Fugu bimaculatus during refrigerated storage

2.6 基于电子舌响应值的PCA分析

图8 双斑东方鲀在冷藏过程中味觉传感器的主成分分析图Fig.8 PCA results of taste sensors of different coldstorage of Fugu bimaculatus

PCA分析是一种利用降维的方式将样本数据转换成成少数几个不相关的综合指标的多元统计分析方法，易宇文[42]等通过对电子舌检测结果进行PCA分析，发现不同储藏期鲢鱼的鲜度都能被其有效识别，且前两个主成分的累计贡献率为95.19%。因此，本文利用spss 22.0对不同冷藏时间双斑东方鲀鱼肉的电子舌响应值进行PCA分析，以PC1为横坐标、PC2为纵坐标绘制PCA分析结果图（图8）。由图可知，4 ℃和0 ℃组前两个主成分总贡献率分别为98.30%和98.90%，且不同冷藏时期鱼肉的滋味特征都得到了很好区分，冷藏1 d位于左下角且与其他冷藏时期相隔较远，3 d和5 d分布于PC1负半轴区域，7 d、9 d和11 d分布于PC1正半轴，其中，冷藏3 d和5 d的鱼肉在PCA分布上较接近，7 d、9 d和11 d较接近，说明冷藏3 d与5 d滋味特征较相似，7 d～11 d滋味特征差异较小。

结合因子载荷图（图9）可知，两组鱼肉在冷藏初期（1 d）主要呈鲜味，0 ℃组冷藏3 d～5 d主要滋味特征为鲜味、涩味，冷藏7 d～11 d鲜味逐渐变弱，苦味和酸味逐渐增强；4 ℃组冷藏前3 d鱼肉的滋味主要呈鲜味，5 d～11 d鱼肉的鲜味较弱，苦味和酸味增强，鱼肉滋味品质逐渐变差，以上结果说明0 ℃和4 ℃的冷藏7 d和5 d时双斑东方鲀的滋味品质发生了较大变化。TVC测定结果显示双斑东方鲀鱼肉在0 ℃和4 ℃条件下的货架期分别是7 d和5 d，与电子舌的检测结果相互印证，说明电子舌技术可用于双斑东方鲀在冷藏过程中的鲜度等级的检测鉴定。

图9 双斑东方鲀在冷藏过程中的主成分分析图Fig.9 PCA results of different coldstorage of Fugu bimaculatus

2.7 TVC、ATP及其关联物和电子舌传感器响应值的相关性分析

对TVC、ATP及其关联物和电子舌传感器响应值进行相关分析，结果显示（图10），除咸味和丰富性2根传感器外，其他6根传感器的响应值和TVC、ATP及其关联物均具有不同程度的相关性（p<0.05），说明可使用电子舌检测双斑东方鲀在冷藏过程中的鲜度变化。

图10 双斑东方鲀冷藏期间电子舌和TVC、ATP及其关联物的相关性分析Fig.10 The correlation among electronic tongue and TVC、ATP and related compounds of Fugu bimaculatusas during chilled storage

2.8 电子舌传感器响应信号与TVC建模分析

2.8.1 预测模型的建立

为进一步利用电子舌技术检测双斑东方鲀的新鲜度，本研究采用kennard-stone法将139个有效样本划分为训练集（90个）与预测集（49个），并以8个传感器响应值作为自变量，通过预测残差总和（PRESS）确定最佳主因子数后，分别建立TVC的偏最小二乘回归（PLSR）和多元线性回归（MLR）的TVC定量预测模型，结果见表1。

有表可知，0 ℃和4 ℃组MLR预测模型的训练集和预测集的决定系数（Rc2和Rv2）均大于PLSR预测模型，均方根误差（RMSEP）小于PLSR预测模型，说明MLR预测模型的稳定性高于PLSR模型。因此，本文选择MLR法构建双斑东方鲀在冷藏过程中过程中的TVC预测模型，结果如图11所示。

图11 TVC预测值与实测值散点图Fig.11 Scatter plots of TVC predicted value and true value

表1 基于PLSR和MLR的预测模型效果比较Table 1 Comparison of PLSR and MLR model performance

2.8.2 定性判别不同冷藏时间双斑东方鲀 的新鲜度

为验证双斑东方鲀TVC定量预测模型的准确性，随机选取12个未参与建模的样品，比较预测TVC值与真实测定TVC值的双斑东方鲀新鲜度评价结果，结果见图12。由图可知，预测TVC值对双斑东方鲀鲜度等级的评价结果与实测TVC值的评价结果一致，说明该模型准确度较高，能够用于双斑东方鲀冷藏过程中新鲜度的检测。

图12 基于TVC预测值和实测值双斑东方鲀新鲜度分级Fig.12 Grading the salmon based on predicated/measured TVC content of Fugu bimaculatusas

3 结论

本研究通过使用电子舌、氨基酸自动分析仪和高效液相色谱仪对不同冷藏（0 ℃和4 ℃）时期的双斑东方鲀的滋味成分进行分析，并对电子舌传感器响应值与TVC、ATP及其关联物进行相关性分析。结果表明，不同冷藏期双斑东方鲀的滋味均主要由鲜味、苦味、涩味、咸味、酸味组成，随着冷藏时间的延长，其滋味逐渐变差，品质不断下降。在冷藏过程中，两组（0 ℃和4 ℃）鱼肉的TVC随着冷藏时间的增加呈上升趋势，并于7 d和5 d达到检出上限6.15 lg(CFU/g)和6.23 lg(CFU/g)；新鲜鱼肉主要呈鲜甜略带苦味，随着时间的增加，鲜味物质含量逐渐下降（如Glu、IMP等），苦味物质增加（如His、Hx等），其中，贮藏末期（11 d）时两组（0 ℃和4 ℃）鱼肉FAA含量较初期（1 d）分别减少了0.37 mg/100 g和0.58 mg/100 g，IMP下降了47.95%和41.58%，His增加了28.37 mg/100 g和86.67 mg/100 g，Hx增加了32.08 mg/100 g、41.44 mg/100 g；电子舌能够对不同鲜度等级的鱼肉进行有效区分，且分析结果与TVC检测结果一致；PCA分析发现，双斑东方鲀鱼肉的味觉差异主要体现在鲜味、苦味和酸味，其中鲜味减弱和苦味和酸味的增强是导致鱼肉在冷藏过程中口感滋味下降的重要原因；利用PLSR和MLR构建了双斑东方鲀冷藏（0 ℃和4 ℃）过程中TVC定量预测模型，其中MLR模型的稳定性较好，其预测集的Rv2和RMSEP分别为0.97、0.99和0.44、0.08。以上研究结果表明，电子舌技术可用于冷藏双斑东方鲀新鲜度的快速检测。