酶解玉米醇溶蛋白-叶黄素纳米粒的制备、结构表征及体外抗氧化和释放特性研究

韩 赫 焦 岩,2 常 影 石 磊 刘志宇 杨又彬

(齐齐哈尔大学，食品与生物工程学院1，齐齐哈尔 161006)(黑龙江省玉米深加工理论与技术重点实验室2，齐齐哈尔 161006)

叶黄素是一种类胡萝卜素，广泛存在于绿色植物中[1]，是一种脂溶性功能成分，具有抗氧化、抗辐射和预防癌症等生理功能[2]，还可以保护视力及减少眼部黄斑变性等疾病(AMD)的发生[3]。但是由于叶黄素是一种含有许多共轭双键的异戊二烯类聚合物[4]，化学性质不稳定，在储存和加工过程中易被氧、高温以及光辐射等因素作用而发生降解和失活，导致其生物利用程度低，在食品加工方面的应用受到极大的限制[5]。因此，采用纳米化包埋对叶黄素进行物理改性，对于提高其结构稳定性、促进机体吸收进而充分发挥其生物活性具有重要意义。

近年来，玉米醇溶蛋白(Zein)作为一种天然高分子材料在食品活性成分载体方面的应用引起了人们广泛的关注。Wang等[6]通过玉米醇溶蛋白/壳聚糖胶体改善和调节乳剂的界面，用一种简便的反溶剂方法制备了具有中性润湿性的高电荷ZCCPs粒子。Huang等[7]采用抗溶剂沉淀和静电沉积相结合的方法制备了白藜芦醇-玉米醇溶蛋白/果胶纳米粒，提高了白藜芦醇的体外抗氧化能力和生物利用度。Dai等[8]采用抗溶剂沉淀技术制备玉米醇溶蛋白-卵磷脂纳米粒，提高了姜黄素的耐热、紫外辐照和高离子强度稳定性。但是，玉米醇溶蛋白胶体颗粒尺寸较大，在水相中容易聚集，且对负载的脂溶性功能成分的控释性能较差。这极大地限制了玉米醇溶蛋白在功能性载体领域中的应用。目前有研究采用酶解法对玉米醇溶蛋白结构进行修饰，改善其疏水性和溶解分散性，提高载运性能。例如，Wang等[9]以玉米醇溶蛋白水解物作为负载姜黄素的载体，提高了姜黄素的水溶性和稳定性。Lin等[10]成功开发玉米醇溶蛋白酶解物作为VD3的纳米载体，有效提高了VD3的光化学稳定性和生物利用率。

酶解改性可以改善玉米醇溶蛋白的功能特性，使其更适合作为功能性活性物质的有效载体，但是如何通过有效的酶解方法对玉米醇溶蛋白进行改性，进而提高对脂溶性叶黄素的负载性能，最终改善其功能活性的研究还鲜见报道。本研究采用反应温和、酶解效率高的中性蛋白酶对玉米醇溶蛋白进行改性，构建酶解玉米醇溶蛋白负载叶黄素纳米载运体系，研究其包封性能和结构表征，并考察其溶解性、抗氧化活性以及体外释放特性。本研究对于改善叶黄素的结构性质及体内吸收利用率，拓展玉米醇溶蛋白和叶黄素的应用领域具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

叶黄素标准品(纯度≥90%)、玉米醇溶蛋白、DPPH、中性蛋白酶(酶活力：50 000 u/g)、无水乙醇、石油醚等试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

H-7650透射电子显微镜，Nano-Zs90纳米粒度和Zeta电位测定仪，RE-52AA旋转蒸发器，CJJ-931四联磁力加热搅拌器，TGL-16G离心机，BS-1E振荡培养箱，UV-2450型紫外分光光度计。

1.3 实验方法

1.3.1 叶黄素含量的测定

配制不同浓度梯度的叶黄素标准液，在445 nm处测定吸光值，制作叶黄素标准曲线，得到线性回归方程：Y=0.005X+0.000 5，R2=0.999。由此可知在0～10 μg/mL质量浓度范围内，叶黄素标准液在445 nm波长处的含量与吸光值线性关系良好[11]。

1.3.2 玉米醇溶蛋白酶解

采用中性蛋白酶(NPT)对玉米醇溶蛋白进行酶解：取一定量的玉米醇溶蛋白加入到去离子水中混匀，加入一定量的中性蛋白酶，调节pH，在40～60 ℃条件下酶解0～120 min。酶反应后在95℃条件下蒸煮5 min灭酶。将得到的玉米醇溶蛋白酶解物冻干，4 ℃下储存备用。

1.3.3 玉米醇溶蛋白酶解物-叶黄素纳米粒(CPH-LUT)的制备[12]

采用反溶剂法制备CPH-LUT。取5.0 mL叶黄素标准液(100 μg/mL)，加入5.0 mL CPH乙醇溶液(2.5 mg/mL)，使其充分混合均匀，在3 000 r/min下离心5 min，取上清液加入18.5 mL的PBS缓冲溶液，在一定温度下搅拌水合30 min，旋转蒸发除去乙醇，随后定容到20 mL，得到CPH-LUT纳米粒溶液。同时在相同条件下制备玉米醇溶蛋白负载叶黄素纳米粒(Zein-LUT)。

1.3.4 包封率的测定[12,13]

取CPH-LUT纳米悬浮液3.0 mL，加入3.0 mL石油醚漩涡混匀60 s，充分提取游离的叶黄素，在3 000 r/min条件下离心5 min，取上清液在445 nm处测其吸光值，计算游离的叶黄素的质量浓度C1，重复3次实验。包封率(EE)的计算公式为：

(1)

式中：C1为叶黄素的质量浓度/μg/mL；V为加入CPH-LUT纳米悬浮液的体积/mL；M为叶黄素的总量/μg。

1.3.5 CPH-LUT制备单因素实验

1.3.5.1 酶解条件对CPH-LUT纳米粒包封率的影响[14,15]

将一定量的玉米醇溶蛋白分散于去离子水中，分别添加1.80%、2.10%、2.40%、2.70%、3%(底物质量按蛋白质质量计)的NPT，将混合液pH分别调整为6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，分别置于40、45、50、55、60 ℃下水解0、30、60、90、120 min，后于95 ℃下保持5 min，对酶进行灭活，终止反应。水解产物经冷冻干燥48 h，按照1.3.3方法制备纳米粒，测定不同酶解条件下对叶黄素的包封率。

1.3.5.2 正交实验

在单因素实验的基础上，采用4因素3水平正交实验优化CPH-LUT制备的最佳条件，正交实验设计见表1。

表1 正交实验因素水平设计表

1.3.6 透射电子显微镜(TEM)观测

将CPH-LUT纳米粒溶液滴加到经等离子体处理(辉光放电)的碳膜载网上，采用红外灯烘干，置于透射电子显微镜下观测CPH-LUT纳米粒的微观结构。

1.3.7 粒径和Zeta电位的分析测定

参考Hu等[16]的方法，取1.0 mL CPH-LUT纳米粒样品置于Nano-90粒径分析仪样品池中进行分析，测定CPH-LUT纳米粒的平均粒径、表面Zeta电位以及多分散系数。

1.3.8 抗氧化活性分析

1.3.8.1 DPPH法测定叶黄素及其纳米粒的自由基清除活性

参考Guan等[17]的方法，取2.0 mL不同纳米粒溶液(叶黄素质量浓度为25 μg/mL)，加入2.0 mL 0.8 mg/mL DPPH溶液，充分振荡后避光反应30 min，517 nm处测定吸光值记为A1；样品中仅加入乙醇作为空白组，记为A2；乙醇代替样品为对照组，记为A0，DPPH自由基清除率计算公式为：

(2)

1.3.8.2 叶黄素及其纳米粒对羟基自由基清除活性

参考蔡建秀等[18]的方法，取0.2 mL不同纳米粒溶液(叶黄素质量浓度为25 μg/mL)，加入1.0 mL 6 mmol/L的FeSO4溶液，1 mL 6 mmol/L的水杨酸溶液混匀后静置10 min，加入1.0 mL 6 mmol/L的H2O2溶液启动反应，避光反应30 min，510 nm处测定吸光值记为A1，以1.0 mL蒸馏水代替FeSO4溶液，记为A2，以0.2 mL蒸馏水代替纳米悬浮液，记为A0，羟基自由基清除率计算公式为：

(3)

1.3.9 溶解分散性分析[19,20]

将叶黄素、Zein-LUT以及CPH-LUT纳米悬浮液分别在5 000 r/min条件下离心10 min，上清液经0.45 m膜过滤，除去不溶性叶黄素，取过滤后的溶液超声振荡5 min，将2.0 mL样品与4.0 mL石油醚混合，漩涡振荡60 s。重复3次实验，取上清液于445 nm处测其吸光值，计算叶黄素溶液浓度C2。溶解度计算公式为：

(4)

式中：C2为叶黄素的质量浓度/μg/mL；V1为石油醚体积/mL；V2为样品体积/mL。

1.3.10 叶黄素纳米粒的体外释放特性

参考田少君等[21]方法配制人工胃液和肠液。取一定量的CPH-LUT纳米悬浮液，按照1∶3的比例加入模拟胃液或肠液，搅拌均匀后置于恒温振荡培养箱中， 在37 ℃，120 r/min的条件下消化6.0 h。按时间梯度0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 h，准确取3.0 mL样品同时补充3.0 mL同温度的模拟胃液或肠液，样品与3.0 mL石油醚旋涡振荡60 s，在4 000 r/min条件下离心5 min，收集上清液于445 nm处测其吸光值，计算释放叶黄素的质量浓度，代入公式计算累计释放率(Qt)[22]：

(5)

式中：Ct为t时刻叶黄素的质量浓度/μg/mL；Vt为t时刻中悬浮液媒介体积/mL；M为叶黄素的总质量/μg。

采用4种常见的动力学模型对CPH-LUT纳米粒在人工胃液或肠液中的释放曲线进行拟合，求得符合叶黄素释放的最佳模型，包括：

零级动力学模型(Qt=kt)、一级动力学模型(ln(1-Qt)=-kt)、Higuchi模型(Qt=kt1/2)、Ritger-Peppas 方程(Qt=ktn)。

式中：Qt为t时刻的累积释放分数；k为释放速率常数；Ritger-Peppas模型中的n值表示释放机制[23]。根据所得方程的相关系数R2, 判断释放方程拟合的最佳模型。

1.3.11 数据统计与分析

采用SPSS进行数据处理和误差分析，利用Origin2017进行数据拟合作图，所有实验重复3次。

2 结果与分析

2.1 CPH-LUT纳米粒制备单因素实验结果与分析

2.1.1 酶用量对CPH-LUT制备效果的影响

由图1可知，随着酶用量的增加，CPH对叶黄素的包封率增大，当酶用量达到2.70%时，包封率最高达到90.13%。随着酶用量的提高，酶分子与底物结合的几率增大[24]，玉米醇溶蛋白的一级结构被破坏，逐渐水解产生CPH，酶解后获得的CPH中具有大量的两亲性多肽片段，与叶黄素结合充分，使得叶黄素的包封率提高，当酶用量超过2.7%时，酶分子已经结合了底物绝大部分作用位点，叶黄素的包封率不再升高。故酶用量为2.7%时，CPH-LUT制备的效果最佳。

图1 不同酶解条件对LUT包封率的影响

2.1.2 酶解时间对CPH-LUT制备效果的影响

未酶解的玉米醇溶蛋白对叶黄素的包封率较低，酶解得到的CPH对叶黄素的包封率随着酶解时间的增加而增大，酶解60 min时，叶黄素的包封效果最好，包封率达到91.43%。酶解时间的继续增加，包封率趋于平稳甚至略有下降。这是因为随着酶解时间的进行，CPH的量逐渐增加，与叶黄素结合能力增强，使得包封率提高。随着酶解时间的延长，酶与蛋白的结合位点减少，且NPT的活性逐渐降低[25]，酶解效率降低。与此同时产生了一部分小分子肽及氨基酸，所以包封率变化略微下降，故60 min为最佳酶解时间。

2.1.3 酶解温度对CPH-LUT制备效果的影响

随着酶解温度的上升，酶解得到的CPH对于LUT的包封效果在40～45 ℃呈现上升的趋势，45 ℃时包封率最高达到91.33%。此时达到了NPT的最适温度，酶分子的活力增强，与底物分子结合率增大，蛋白适度酶解，对叶黄素包封率提高。随着温度的不断上升，酶活性下降[25]，蛋白也会发生变性且开始聚集，从而使得包裹叶黄素的效果呈下降趋势。

2.1.4 酶解pH对CPH-LUT制备效果的影响

随着pH值的增加，酶解得到的CPH对叶黄素的包封率呈现先增加后降低的趋势，当pH为7.0时，纳米粒包封率最大，为91.04%，当pH大于7.0时，包封率开始下降。这是因为中性蛋白酶(NPT)的活性在pH为7.0时最佳，此时有助于与底物玉米醇溶蛋白的活性位点结合，酶解效果增强。然而随着pH值的持续升高，强碱环境会影响玉米醇溶蛋白的空间构象，同时使得NPT活性降低，从而导致对叶黄素包封率降低。因此pH为7.0时酶解效果最佳。

2.2 正交实验结果与分析

由表2和表3综合分析可知，不同酶解条件下CPH对叶黄素包封率的影响大小依次为：A(酶用量)>C(酶解温度)>B(酶解时间)>D(酶解pH)，最佳组合为A2B2C3D1。酶用量2.7%，酶解时间60 min，酶解温度50℃，酶解pH 6.0，该组为最佳实验组，包封率为92.1 %。根据K值最优组合为A2B2C2D3，进行3次验证实验，得到此条件下纳米粒平均包封率为(91.6±0.62)%，小于组合A2B2C3D1的包封率。由此确定当酶用量2.7%，酶解时间60 min，酶解温度50 ℃，酶解pH 6.0条件下，CPH对叶黄素的包封效果最好。

表2 正交实验结果

表3 正交实验设计F值

2.3 透射电子显微镜(TEM)结果与分析

CPH-LUT纳米粒在100、200、500 nm处TEM图如图2所示，CPH-LUT纳米粒表面光滑，外观呈现球形结构，粒径分布匀称，在水中的分散性较好， LUT能够与CPH载体结合形成纳米微粒结构，对其结构和生物活性起到有效的保护作用。此外，CPH-LUT的粒径在200 nm范围，与Nano粒径分析仪测定结果一致[26]。

图2 CPH-LUT的透射电镜图

2.4 CPH-LUT粒径及Zeta电位结果分析

CPH-LUT纳米粒的粒径和电位分布分别如表4、图3和图4所示。由表4和图3可知，纳米粒颗粒度范围在95.07～356.2 nm，平均粒径为173.7 nm，多分散系数为0.077。由图4可知，CPH-LUT纳米粒的Zeta电位为-18.1 mV，分布范围较窄，粒子间静电排斥作用较强，分散效果较好。表明CPH-LUT纳米粒分散性良好，规整度较高，粒径分布均匀稳定，有助于生物活性的发挥。

表4 CPH-LUT粒径百分比

图3 CPH-LUT粒径分布图

图4 CPH-LUT电位分布图

2.5 不同纳米粒的抗氧化能力比较分析

如图5所示，游离叶黄素的抗氧化活性均较低，CPH-LUT纳米粒的抗氧化活性高于Zein-LUT纳米粒以及游离叶黄素。这是由于叶黄素自身性质不稳定，在制备纳米粒过程中发生损失或失活，所以游离的叶黄素抗氧化活性较低。随后当等量的叶黄素与玉米醇溶蛋白或CPH结合之后，其抗氧化能力均有所提高，这可能有两方面原因：一是玉米醇溶蛋白或CPH包埋叶黄素后，降低了外界环境对于叶黄素的影响，使得其抗氧化能力增强；二是玉米醇溶蛋白或CPH自身具有一定的抗氧化能力，能够对叶黄素提供一定的保护能力[27]。CPH本身具有更高的抗氧化能力，所以CPH-LUT的抗氧化能力最高。

图5 不同纳米粒的抗氧化能力比较

2.6 溶解分散性分析结果

由图6表明，当在相同浓度下，CPH-LUT纳米粒的溶解度最高，高于Zein-LUT纳米粒溶解度，是LUT溶解度的3倍。这可能是因为在采用反溶剂法制备纳米粒的过程中，LUT与玉米醇溶蛋白或CPH通过氢键等非共价作用产生结合后形成分布均匀的纳米颗粒，从而抑制了LUT的进一步聚集与沉淀[27]。同时，酶解后的CPH因分子量较小且疏水性降低，导致水溶性增强，因此叶黄素与CPH形成的复合纳米粒在水中的溶解度明显高于Zein-LUT和游离叶黄素。

图6 不同纳米粒溶解度差异

2.7 CPH-LUT纳米粒的释放特性

由图7所示，CPH-LUT纳米粒在胃液中释放率较低，而在肠液中CPH-LUT纳米粒的释放明显高于在胃液中的释放，在5 h时，释放率最大可达到40.8%，随后由于叶黄素存在一定的降解作用，叶黄素释放率逐渐降低。说明CPH对包埋的叶黄素具有一定的缓释作用。

图7 CPH-LUT纳米粒在模拟胃液和模拟肠液中的释放

以零级释放方程、一级释放方程、Higuchi平面扩散以及Retger-peppas方程分别对于CPH-LUT纳米粒在胃液和肠液6 h内释放曲线进行线性拟合。结果如表5和表6所示， CPH-LUT纳米粒在胃液以及肠液中的释放曲线，对应的一级释放方程明显优于其他模型，说明CPH-LUT纳米粒在胃、肠液中的释放均符合一级动力学模型，属于恒比释放。而在Retger-peppas模型中，胃肠液释放存在一定的差异，CPH-LUT纳米粒在胃液中的释放因子n=0.423 2<0.45，说明CPH-LUT纳米粒在胃液6 h

表5 CPH-LUT纳米粒在胃液中释放曲线动力学方程拟合结果

表6 CPH-LUT纳米粒在肠液中释放曲线动力学方程拟合结果

的释放是以Ficks扩散为主。而CPH-LUT纳米粒在肠液中的释放因子0.45

3 结论

对玉米醇溶蛋白进行酶解改性，结合反溶剂法构建了玉米醇溶蛋白酶解物负载叶黄素纳米体系。确定玉米醇溶蛋白最佳的酶解条件为：酶用量2.7%，酶解时间60 min，酶解温度50 ℃，酶解pH 6.0，在此条件下对叶黄素的包封率最高可达到92.1%；该纳米粒的平均粒径为173.7 nm，多分散系数为0.077，Zeta电位为-18.1 mV，透射电镜证实了该纳米粒具有良好的微观结构，且显示出良好的分散性和规整度；经酶解后的玉米醇溶蛋白对叶黄素的溶解性和抗氧化活性具有明显的改善作用；体外释放动力学研究表明，玉米醇溶蛋白酶解物对于叶黄素的释放具有一定的缓释作用，且释放效果良好，在胃液中的释放属于Ficks扩散，在肠液中的释放是在扩散以及纳米颗粒溶蚀二者共同作用下进行的，皆符合一级动力学模型。