猪肾脏异种移植的研究进展

于佳庆,方一晽,方铭慧,安培培,胡 正

（吉林大学第一医院器官再造与移植教育部重点实验室，吉林 长春130061）

异种移植是指将一个物种的器官移植到另一物种体内，最早关于异种移植的报道［1］是1667年羊血输入人体的相关研究。异种肾脏移植始于1905年法国研究者［2］将兔肾移植给1例肾衰竭儿童。在1920—1990年关于非人灵长类动物（nonhuman primate，NHP）的肾脏和心脏移植研究中，研究者［3］发现：非人灵长类动物在伦理学、跨物种微生物感染和器官大小等方面均存在问题，难以作为异种器官移植的理想供体；而猪的器官大小、代谢过程及生理特点等方面与人类相近，并且易于繁育和开展基因编辑，已被公认为理想的异种器官供体来源。目前基因编辑猪已被广泛应用于异种移植研究领域。NHP是开展异种肾脏移植研究和评估其临床转化安全性和有效性的最为理想的动物模型［4］，现阶段基于猪肾到NHP的异种移植研究在克服免疫排斥反应、延长移植物存活时间和增强移植器官生理兼容性等方面取得了一系列进展，展现出良好的临床应用前景。目前异种移植相关的报道均以介绍异种移植整体的研究进展为主，关于猪异种肾脏移植排斥反应和功能障碍的进展报道较少。本研究从异种肾移植面临的免疫排斥、凝血/生理兼容性问题和跨种属感染风险等挑战及制备基因编辑猪推动异种肾移植发展的贡献方面进行总结，并展望异种肾移植未来的发展趋势。

1 猪异种肾脏移植临床应用的意义

迄今为止公认的治疗终末期肾病的最理想方法是进行肾脏移植，但肾脏供需关系之间的严重失衡已成为限制肾移植应用的主要瓶颈问题。根据美国卫生与公共服务部［5］的统计数据：截至2020年9月，有99 522例肾病患者在等候肾源，而肾脏捐献者只有12 652人。据估计［6］，我国每年约有150万人需要接受器官移植治疗，但器官捐献人数仅有约10 000人。异种猪肾脏移植具有许多优势：猪的器官大小、生理和生化指标与人十分接近；猪繁殖效率高，可大量提供异种供体器官；猪细胞的基因编辑的克隆技术成熟，有助于较为快速制备多基因编辑动物；此外，相对于NHP器官移植，猪肾移植的伦理学问题较少，且跨种属微生物感染风险较小［7］。因此，猪肾异种移植被被寄予厚望。然而，由于猪与人的遗传背景差异较大，异种移植后易引起强烈的排斥反应［3］，其临床应用仍需要克服诸多障碍。

2 猪异种肾脏移植临床应用的主要障碍

猪到NHP肾移植的研究成果已发展至临床应用阶段，需要克服诸多困难。异种供受体之间的免疫排斥反应、凝血调节功能紊乱和猪与灵长类动物器官之间的生理兼容性问题均会对猪肾脏的存活状态与生理功能造成影响，最终导致移植失败。

2.1 异种移植免疫排斥反应

异种免疫排斥反应是异种肾移植需要解决的首要问题，主要分为超急性免疫排斥反应（hyperacute rejection，HAR）、急性体液异种排斥反 应（acute humoral xenograft rejection，AHXR）和T细胞介导的移植排斥，上述反应会对移植物造成不同程度的损伤，最终导致宿主死亡。

2.1.1 HAR HAR是由供体猪内皮细胞上的α1，3Gal（Galα1-3Galβ1-4GlcNAc）表位与受体体内的天然异种反应抗体相结合而引起，天然抗体使补体活化，从而在几小时内引起大量出血和血栓形成。α1，3Gal在微生物与大多数低等哺乳动物体内表达，但在人类以及灵长类哺乳动物中不表达，因此人类与灵长类哺乳动物体内含有能与α1，3Gal特异性结合的天然异种反应性抗体。去除供体表达的α1，3Gal抗原与受体体内的α1，3Gal特异性抗体可以有效缓解HAR［8］。

2.1.2 AHXR 当HAR反应被抑制时，宿主体内少量的非α-Gal异种反应性抗体可以与异种供体器官内皮细胞表面的抗原结合，导致补体激活，引发由NK细胞和巨噬细胞介导的细胞毒作用及活化内皮细胞等并发症，最终引起AHXR［8］。AHXR的病理表现为猪的肾脏内皮细胞活化、血栓形成和血管收缩，进而导致肾脏损伤。目前抑制AHXR的主要策略是清除宿主体内的非α-Gal异种反应性抗体。

2.1.3 T细胞介导的移植排斥 T细胞介导的免疫排斥也是导致异种器官移植失败的主要因素。异种移植过程中识别异种抗原的T细胞活化分为直接激活与间接激活2种途径。T细胞的直接激活是宿主的T细胞受体（T cell receptor，TCR）识别移植物抗原提呈细胞（antigen-presenting cell，APC）表面的猪白细胞抗原（swine leukocyte antigen，SLA）分子，进而引发了T细胞介导的移植物排斥作用［9］。间接途径的作用方式是宿主T细胞识别由宿主APC表面的MHC分子提呈的猪的抗原肽，进而引发宿主T细胞活化、B细胞活化以及体液异种排斥。T细胞活化会产生活化巨噬细胞和NK细胞的细胞因子，进而激活天然免疫系统，使移植物最终丧失功能［10］。与同种异体的T细胞介导排斥反应比较，异种移植T细胞直接激活引发排斥的程度与同种异体排斥相当，而间接激活途径显得更加剧烈［11-12］。T细胞介导的移植排斥会引发天然免疫反应，引起猪肾脏的功能障碍。

2.2 凝血调节功能异常

异种移植免疫反应是产生凝血功能障碍的主要原因［8，13］，主要表现为血栓性微血管病变和弥散性 血 管 内 凝 血 （disseminated intravascular coagulation，DIC）［14］。由于少量抗体与移植物内皮细胞结合、补体沉积均会导致内皮细胞活化进而使内皮细胞的抗凝血功能被破坏［15］。猪的凝血-抗凝系统与NHP模型凝血系统中的分子不相容也会加剧凝血障碍的程度，这是因为活化的血管内皮细胞促进凝血，并且猪的抗凝血因子无法有效阻止血液凝固［16］。凝血系统紊乱使血管内形成血栓，继而引起移植物功能障碍，最终导致移植失败。

2.3 生理功能兼容性问题

虽然猪的肾脏与人的肾脏在结构和大小上具有一定的相似性，但是在生理功能方面存在一定的差异，这些差异可能会影响移植肾在受体体内的存活。如猪的肾脏可以通过尿素氧化酶代谢尿酸［17］；在肾素-醛固酮系统中，人的血管紧张素原无法被猪的肾素分解［9］；移植物在功能稳定后会伴随低磷血症［18］等问题。其中最明显的一点是移植后受体出现明显的蛋白尿和低蛋白血症，且需要补充白蛋白［18-19］。

蛋白尿的出现会引发肾病综合征，使移植物丧失功能，这是生理功能障碍中最严峻的挑战。血管内形成血栓和感染均会导致蛋白尿的出现，组织学表现为肾小球系膜轻微扩张［20］。猪到狒狒的肾移植实验［21］中发现：当带血管的胸腺与来自同一供体的肾脏移植到受体体内后，肾脏维持了正常的功能，延长了存活时间，但是术后出现了明显的蛋白尿，说明蛋白尿并非由T细胞介导，也非由抗体介导引起。目前蛋白尿产生的原因尚未明确，需要继续研究明确。

2.4 肾脏大小差异

由于猪与人的器官在生长速度上存在一定差异，因此配体与供体之间的匹配显得尤为重要。在以青少年为例的特殊人群中，移植器官在有限的空间内快速生长可能会导致功能性障碍［22］。SION等［23］在6例猪到NHP肾移植的研究中发现其中3例移植体的移植物持续生长，最终导致移植失败。SHAH等［22］发现：当供体猪肾脏的体积与受体体质量的比值大于25 cm3·kg－1时，供体肾功能将会受损，并最终丧失功能。其原因可能是受体循环系统中的血容量不足以维持移植物生长使移植肾的皮质因缺血而受损，随着肾脏在有限的腹腔内生长，最终形成外源性的压迫使移植物功能进一步受损。找出移植器官生长的原因对改善这一问题具有积极的意义，或许可以通过对调控器官生长的基因进行编辑［24］来改善这一状况。

2.5 潜在感染风险

异种移植中，非人源器官引起的感染风险同样值得引起重视。供体与宿主之间不同微生物的相互作用和宿主免疫功能的抑制会引起细菌或病毒感染。异种移植过程中，当宿主的免疫功能受到抑制后，宿主体内的病原体和猪的相关病原体均有可能出现，早期基于小型猪与NHP异种移植的研究中，FISHMAN等［25］在猪的器官中检测到放线菌和链球菌。耐药菌的出现与抗生素的应用有一定的相关性。

由于器官移植中移植物与宿主含有不同的MHC分子，T细胞介导的抗病毒反应受到抑制，病毒感染同样较为常见，并且会因为移植排斥和免疫抑制等因素加重。在异种移植中，宿主可能会因此感染猪巨细胞病毒（porcine cytomegalovirus，PCMV）、猪嗜淋巴疱疹病毒（porcine lymphotropic herpesvirus，PLHV）和猪内源性逆转录病毒（porcine endogenous retrovirus，PERV）等。在猪到NHP的移植研究中，猪巨细胞病毒只在肾移植过程中引起感染，导致消耗性凝血与早期移植物丢失［26-28］。猪嗜淋巴疱疹病毒具有物种特异性，不会引起宿主的全身感染［29］。猪内源性逆转录病毒可能会通过插入效应引起宿主基因表达调控的改变，继而引起无症状感染或增加癌变等风险［25］。

3 异种肾移植的研究进展

随着分子生物学技术和免疫学技术的不断发展，异种肾移植在多基因编辑猪、T细胞免疫抑制、低蛋白血症与蛋白尿和跨种属感染等方面均有显著进展。尤其是基因编辑猪的出现使得免疫排斥和凝血功能异常等问题得到缓解。基因编辑猪的供体肾配合免疫抑制剂的应用极大地延长了NHP肾移植研究中移植肾的存活时间，为开展相关的临床研究提供了基础。

3.1 基因编辑猪在异种肾移植中的应用

通过基因编辑技术将表达α1，3Gal表位的基因敲除，使得供体器官内皮细胞中不表达该抗原，消除了α1，3Gal介导的HAR反应［20］。YAMADA等［30］在2005年报道了采用GALT敲除（GalT-KO）猪的供体肾在狒狒体内存活了83 d，并且维持了正常的肌酐水平。陈刚等［31］在急性体液异种排斥中发现高浓度的非抗Gal抗原的抗体，上述抗体介导了补体依赖的细胞毒作用，说明非抗Gal的抗体可以诱导AHXR。但是在T细胞耗竭的GalT-KO猪肾移植中并未发现AHXR反应［30，32］，表明该种非Gal抗体的产生可能是T细胞依赖的。

为了克服微血管病变和血栓形成所带来的凝血障碍，出现了可以表达1个或多个补体调节蛋白（例如CD55和CD46［33-34］等）的GalT-KO猪。2004年，表达CD55的猪肾脏可在食蟹猴体内存活90 d［35］。2015年HIGGINBOTHAM等［36］将CD55-GalT-KO猪的肾脏移植到低滴度抗猪抗体的猴子中发现：联合抗CD154单克隆抗体使受体存活多于130 d。有研究者［37-38］报道移植表达人凝血调节基因供体猪肾后的存活时间：其中体内含有高滴度的抗猪非α1，3Gal抗体（Ig M和IgG）的狒狒存活了136 d，非α1，3Gal抗体滴度较低的2只狒狒存活到237 d和260 d，而且具有正常的肾功能。

目前借助ZFNs、TALENs和CRISPR/Cas等基因编辑技术，产生了多种基因修饰猪［39］，使得肾脏在异种移植后的存活时间不断延长（表1），有效地推动了异种移植领域的研究进程，随着越来越多与免疫反应相关的基因位点的出现，基因编辑猪的应用将会更加广泛。

3.2 T细胞免疫抑制策略

目前在异种肾移植中，抑制T细胞介导的免疫排斥的常见方案有T细胞耗竭和共刺激通路阻断。根据2种抑制方案，多种药物被应用于临床前研究（表2）。T细胞耗竭的常用方法包括使用抗T细胞的单克隆或多克隆抗体、放射治疗以及使用环磷酰胺等化疗药物［42］。抗胸腺细胞球蛋白（antithymocyte globulin，ATG）是耗竭T细胞的常用试剂，在异种肾移植的研究中使用ATG可延长受体生存期达2～3个月［43］。T细胞耗竭在克服T细胞介导的免疫排斥中较为重要。

表1 猪到NHP异种肾移植的移植物存活记录Tab.1 Survival record of grafts in kidney xenotransplantation from pig to NHP

表2 T细胞免疫排斥中常用药物Tab.2 Medicines commonly used in T cell immune rejection

胸腺是T细胞成熟与发育的场所，对维持宿主体内理想的免疫微环境具有重要作用。异种移植中，切除受体胸腺并移植猪的胸腺，受体体内重建的T细胞将猪的MHC分子识别为受体自身的MHC分子，进而引起T细胞的免疫耐受。YAMADA等［20］将GalT-KO猪的肾脏与带血管胸腺一同移植至切除胸腺的狒狒体内，肾脏的最长存活时间由30 d延长至83 d。说明诱导T细胞免疫耐受在克服T细胞引起的免疫排斥反应具有一定潜力，但猪胸腺内的自身反应性T细胞能否完全去除仍未可知，诱导免疫耐受的方案仍具有理论上的风险。

T细胞的活化不仅需要TCR与MHC分子结合，同时也依赖于共刺激信号的递送，阻断共刺激信号可以导致T细胞失能。在阻断共刺激信号的药物中，抗人CD154单克隆抗体较为常用［43］。HIGGINBOTHAM等［36］构建的NHP模型显示：CD154单抗阻断T细胞的共刺激通路使得受体存活时间多于130 d。在CD28/CD80与CD40-CD154这2种阻断方式的比较中，HIGGINBOTHAM等［36］发现：CD40-CD154可以有效阻止T细胞激活。有研究［41］表明：在选择低滴度抗猪抗体的NHP模型的前提下，选择性去除CD4+T淋巴细胞与抗人CD154单抗联合用药，可以使受体存活期达到400 d，说明CD4+T淋巴细胞在异种移植排斥中具有更关键的作用。因此T细胞耗竭与阻断共刺激通路联合应用可以有效延长异种肾脏的存活时间。虽然抗人CD154单抗可在一定程度上延长移植物的存活时间，但SCHULER等［48］在食蟹猴的同种异体肾移植研究中发现：应用了抗人CD154抗体的宿主在移植后出现了肾脏的可逆性功能衰退，血小板数量降低，甚至伴有血栓栓塞性血管病变导致的肺部出血的现象，而同样应用了抗人CD154的食蟹猴自体肾移植中却未观察到此类现象。说明抗人CD154单抗具有引起血栓形成的潜在风险，并且不是由抗体自身的毒性引起。因此抗CD154单抗在临床上的应用还存在较多限制。

3.3 蛋白尿和低蛋白血症的研究进展

在人同种异体肾移植中，鞘磷脂磷酸二酯酶样3b （sphingomyelin phosphodiesterase like 3b，SMPDL-3b）的缺失会导致局灶性肾小球硬化的患者在移植后出现蛋白尿［49］。TASAKI等［50］发现：猪到狒狒的肾移植实验中，利妥昔单抗可以对猪足细胞中的SMPDL 3b提供保护，使蛋白尿得以延缓；体外实验［22］研究结果显示：SMPDL-3b对猪肾小球起重要作用。抗CD20利妥昔单克隆抗体可以与SMPDL-3b结合从而抑制肾小球损伤，说明利妥昔单抗可以起到延缓蛋白尿的作用。体内实验［50］也证明了这一点，但是该方法的效果并不持久，只能维持2～3周。足状树突细胞表达CD80，也可以呈递抗原，有研究［51］表明：在肾病综合征患者的尿液中CD80含量较高。在儿童肾病中常见的微小病变病（minimal change disease，MCD）中，CTLA-4可以与CD80结合，进而抑制足状树突细胞的激活，从而减轻MCD的症状。MCD同样与CTLA-4的遗传多态性有关［52-53］。在异种肾移植中，TANABE等［54］在患有肾病综合征的样本中发现：患病狒狒尿中的CD80表达增加，肾小球上也发现了CD80的表达，说明异种移植中的蛋白尿与CD80的表达有关；采用CTLA-4抗体与抗CD40L的免疫方案改善了移植GTKO猪肾脏的狒狒的蛋白尿的情况。CD80与CTLA 4在蛋白尿的预防中具有重要作用，通过减少CD80的表达可以减轻异种移植中蛋白尿的程度。

3.4 降低跨种属感染风险的方法

可以通过供体筛选与抗生素的合理使用来降低细菌引起的异种移植感染风险。对供体猪群体进行血清学测试、显微观察和常见病原微生物的培养可以达到较为理想的效果［25］，用于异种移植的猪在生物安全设施中喂养也能杜绝来自外界环境的病原体感染。

PCMV与PHLV的感染风险可以通过严格筛选供体猪及圈养在生物安全设施中来避免［55］。猪内源性逆转录病毒在所有猪组织中均有表达，其分型有3种（PERV-A、PERV-B和PERV-C），其中PERV-A和PERV-B的受体在人类体内可以检测到，PERV-C主要感染猪的细胞。PERV-A和PERV-B与PERV-C重组在体外实验中被证实可以感染人的细胞［56］。目前拟解决逆转录病毒感染的方案有筛选缺失猪内源性逆转录病毒表达基因或携带少量PERV-C型的供体、疫苗接种、RNA干扰和敲除表达猪内源性逆转录病毒的相关基因［57］。GÜELL等［58］采用CRISPR-Cas9技术靶向敲除了PK-15细胞系上表达猪内源性逆转录病毒聚合酶的基因，并分离出100%不表达PERV的PK-15细胞系。

目前尚无任何证据表明内源性逆转录病毒可以在宿主体内存活超过48 h并传播给人类，在相关临床研究中也未发现抗PERV抗体以及整合前的病毒，关于其感染致病的风险还需进一步研究。

4 总结和展望

作为解决器官短缺的方案之一，异种移植的前景十分广阔。基因编辑猪的出现使得诸如HAR反应和凝血系统紊乱等障碍都得到了极大改善。目前通过采用多基因编辑的供体猪肾脏，联合T细胞耗竭与阻断T细胞共刺激通路的免疫方案，已经极大延长了受体的存活时间。目前对猪进行基因编辑仍有巨大的操作空间，譬如敲除猪的SLA分子或下调其表达水平，插入人的MHC分子或者敲入诸如CTLA-4融合蛋白等，均可以通过减少外源性免疫抑制药物的使用，最终实现诱导灵长类受体对猪肾脏的耐受［7］。供受体器官生长速度不一致同样有望通过编辑调节器官生长速度的相关基因靶点来解决。有研究［59］已经发现新的异种反应性抗原，但异种移植后蛋白尿的发病机制等问题仍然需要继续研究，潜在的感染风险是否存在以及如何规避依然需要进一步讨论。