马来酸噻吗洛尔治疗血管瘤的作用机制探讨

赵 蓓，周夕湲，梁成琳，张丽霞

(四川省医学科学院·四川省人民医院皮肤病性病研究所，四川 成都 610072)

血管瘤属于良性肿瘤，可发生于全身各处，女性的发病率要高于男性。婴幼儿型血管瘤是小儿最常见的良性肿瘤[1]。然而，传统治疗在临床应用方面的总体疗效并不令人满意，迫切需要更为有效的治疗手段和干预措施。leaute-labreze等在2008年首次报道尝试普萘洛尔用于婴幼儿血管瘤治疗后，逐渐引起了各国学者的关注[2]，为血管瘤的治疗提供了新途径。目前β-受体阻滞剂在婴幼儿血管瘤治疗中逐渐得到应用[3]。然而，β-受体阻滞剂作为替代激素的一线治疗药物，其治疗血管瘤的作用机制、适应证及安全性等问题一直是从事血管瘤研究的基础和临床工作者们关注的重点[4，5]。血管瘤中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)较正常组织及消退期血管瘤表达明显增高。如果能通过相关通路验证经过β-受体阻滞剂治疗后使得VEGF分泌减少，探究到马来酸噻吗洛尔作为β-受体阻滞剂的可能作用机制，则可为血管瘤的临床用药和进一步机制研究提供基础。

1 资料与方法

1.1 一般资料收集四川省人民医院病理科2018年6月至2019年6月血管瘤新鲜组织18例，来自手术切除的血管瘤患者，其中男11例，年龄(36.2±11.2)岁，女7例，年龄(26.5±10.6)岁；患者均符合中华医学会2019年颁布的《血管瘤和脉管畸形的诊断及治疗指南(2019 版)》中的相关诊断标准[6]。

1.2 方法

1.2.1瘤体细胞培养 参考文献制备肿瘤细胞悬浮液[7]，使用PBS洗涤新鲜的血管瘤组织样品并转移到无菌培养皿中。将组织切碎成细块状(1 mm×1 mm)并再次用PBS洗涤。然后将组织用2 mg/ml胶原酶(Invitrogen，CA)消化至少2小时，在37 ℃下振荡。通过使用移液管尖端重复吹打将细胞分散，并通过100 μM尼龙细胞过滤器过滤。将细胞以2×105的密度接种在低附着培养皿上使用干细胞培养(SCC)培养基(Invitrogen，CA)的细胞/ml，由Knockout DMEM，15%Knockout血清替代物，1×非必需氨基酸(NEAA)和20 ng/ml两种碱性成纤维细胞组成。生长因子(bFGF)和人内皮生长因子(hEGF)。肿瘤球大约每7天传代1次(大约200个细胞/球)；用PBS洗涤球体1次，然后通过与2 mg/ml胶原酶IV在37 ℃温育10分钟制备单细胞悬浮液。

1.2.2Western blotting 检测VEGFR表达收集血管瘤组织和瘤旁组织，使用PBS进行清洗，提取总蛋白进行Western blotting实验。VEGFR抗体购自CST公司(货号Cat：#2479)，稀释比例1∶1000。使用GAPDH为内参照，GAPDH一抗购自CST公司(货号Cat：#5174)，稀释比例为1∶5000。

1.2.3定量PCR(Real time-PCR) 检测CDC42，MAPK，PI3K基因表达情况将肿瘤球接种到培养皿上，并在细胞培养基中暴露于0、2、4 nM马来酸噻吗洛尔(参见方法，IH肿瘤球培养物)10天，进行细胞计数。在培养的第5天收集添加0、2 nM马来酸噻吗洛尔的肿瘤球细胞，通过胶原酶IV解离成单个细胞并计数细胞数。每个样品一式三份进行RT-PCR试验。进行总RNA提取，逆转录成cDNA，之后进行定量PCR。体系(总体积10 μl)如下：cDNA1 μl，Primer(50 pM)上下游各0.1 μl，2×PCR MIX (Roche)，ddH2O 3.8 μl。定量PCR退火温度60 ℃，40个循环。

1.3 统计学方法采用SPSS 18.0进行数据分析。计量资料以均数±标准差表示，两组间比较采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血管瘤组织细胞培养和VEGFR表达检测VEGFR在血管瘤组织细胞中表达明显高于瘤旁中的表达(P<0.01)。见图1。

图1 VEGFR在血管瘤组织中的表达 a.血管瘤和瘤旁组织VEGFR和GAPDH Western blotting原始电泳条带图；b.血管瘤组织VEGFR表达 **与瘤旁组比较，P<0.01。

2.2 RT-PCR结果通过对马来酸噻吗洛尔作用时间和作用浓度分析，实验结果发现，培养的瘤体球细胞进行第0、5、10天的细胞计数表明添加了不同浓度的马来酸噻吗洛尔(0、2、4 nM)对肿瘤球细胞的生长具有抑制作用，见表1。

表1 不同时期不同浓度的马来酸噻吗洛尔对肿瘤球细胞数

2.3 马来酸噻吗洛尔对VEGF合成的通路中的关键基因表达量的影响根据实验结果，我们选取中间点第5天添加马来酸噻吗洛尔分别为0 nM和 2 nM的肿瘤球细胞进行基因表达量的验证。马来酸噻吗洛尔对肿瘤球细胞中所有验证基因表达量均出现了下调，CDC42、MAPK、PI3K基因表达水平均明显下调，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 2nM马来酸噻吗洛尔对血管瘤培养细胞CDC42、MAPK、PI3K表达的影响

3 讨论

血管瘤是小儿最常见的由血管内皮细胞大量增生引起的良性肿瘤。VEGF作为血管内皮细胞特异性生长因子，作用于血管内皮细胞，促进血管内皮细胞的增殖，参与血管瘤的发生和发展[5]。既往研究提示VEGF是血管瘤的作用靶点之一。

目前血管瘤的治疗方式包括手术、药物、同位素、激光等。而作为药物治疗的一种方法，应用β-受体阻滞剂治疗婴幼儿血管瘤的安全性和有效性较好，有效率60%～90%，其中以普萘洛尔最为广泛。但是该药具有较高的脂溶性，易通过血脑屏障，临床上部分患儿可出现神经系统反应。理论上，局部用药具有降低药物使用剂量，增加局部组织药物浓度，以及使用更方便、副作用更少等优点，但也受药物剂型、透皮吸收能力等影响较大。根据有学者Meta分析的结果[8]，噻吗洛尔局部外用治疗血管瘤的疗效较明显，和口服普蔡洛尔治疗血管瘤效果统计学上无显著差异。马来酸噻吗洛尔作为β-受体阻滞剂，可能通过抑制G蛋白偶联的cAMP依赖蛋白激酶(PKA)的激活，从而抑制ERK/MAPK通路的激活，使VEGF分泌减少，降低血管瘤的成血管能力[9，10]。我们选取ERK/MAPK通路上的某些关键基因进行表达量的验证。从细胞生长结果中非常明显揭示了噻吗洛尔能够有效抑制血管瘤细胞VEGF的表达，说明噻吗洛尔是作用很强的非选择性β受体阻滞剂。下游表达基因PI3K的表达量减少说明激活G蛋白/MAPK级联的激酶利用率下降，G蛋白偶联受到抑制，从而抑制下游 MAPK 通路[11，12]。本研究结果提示马来酸噻吗洛尔可能通过抑制G蛋白偶联，并且抑制ERK/MAPK通路的激活，使得VEGF分泌减少。

本研究初步揭示了马来酸噻吗洛尔抑制血管瘤细胞VEGF分泌的初步作用机制。这也提示我们是否可从ERK/MAPK通路上进一步寻找更多可能的药物作用靶点基因，通过联合用药或增加药物透皮吸收的方式增强临床治疗效果。但是本研究仅仅是细胞水平的研究，存在一定的局限性，所以下一步我们会考虑将肿瘤细胞移植到小鼠体内，建立动物模型的方式进一步对其作用机制进行探究。