生鲜肉中3种食源性致病菌Taqman多重荧光定量PCR检测方法的建立

陈秀琴 林 甦 郑 敏 黄梅清＊

（1.福建省农业科学院畜牧兽医研究所 福州 350013；2.福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心 福州 350013）

目前对食源性致病菌的检测主要是依赖传统的分离培养技术结合细菌的生物化学鉴定。这些方法耗时、费力、灵敏度低，无法定量分析食品中的食源性致病菌[2]。此外，有些致病菌无法通过培养基培养，因而结果存在假阴性的可能性[7]。近几十年来发展起来的分子生物学方法已经被广泛应用于食源性致病菌的检测，其中荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）具有特异性强、灵敏度高等优点，被认为是一种具有应用前景的方法。本研究通过选用特异性良好的靶基因来设计引物探针，建立一种检测沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157:H7三种致病菌的多重荧光PCR方法，并将该方法应用于生鲜肉检测。

1 材 料

1.1 标准菌株 试验所用的16株标准菌株来源及相应的菌株编号见表1。

表1 试验用菌株

1.2 试剂和培养基 细菌基因组DNA提取试剂盒（北京TIAGEN生化科技有限公司）；2×Premix Ex Taq(Probe qPCR)试剂盒、RNase-free和pMDTM18-T载体（大连TaKaRa生物工程有限公司）；胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒（OMEGA公司）；缓冲蛋白胨水（BPW）、亚硫酸祕琼脂平板（BS琼脂）、沙门氏菌显色培养基、7.5%氯化钠肉汤、血平板、金黄色葡萄球菌显色培养基、改良EC新生霉素肉汤、普通营养琼脂培养基、大肠杆菌O157显色培养基、改良山梨醇麦康凯培养基（广东环凯微生物科技有限公司）。

1.3 主要仪器 7500荧光定量PCR仪（美国应用生物系统公司）；NanoDropND-1000核酸浓度测定仪（美国赛默飞世尔公司）；拍击式均质器(法国英特塞恩斯有限公司)。

1.4 引物和探针 在GenBank分别下载沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157:H7的invA、nuc和wzx基因序列，应用Beacon Designer version 7.51设计引物和TaqMan探针。通过NCBI Blast检测特异性。引物和探针序列见表2，引物探针均委托大连TaKaRa生物工程有限公司合成。

2 方 法

2.1 细菌基因组DNA提取 取各菌株对数生长期的新鲜培养物，按照细菌基因组DNA抽提试剂盒（北京天根）说明书提取制备DNA模板。用核酸浓度测定仪测定出DNA浓度与纯度，DNA模板置于-20℃下保存备用。

2.2 单重qPCR扩增 反应体系：2×Premix Ex Taq(Probe qPCR)12.5μL，上下游引物各1μL，探针1μL，模板1μL，ddH2O补足至25μL。反应条件：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，收集荧光，35个循环。

2.3 多重qPCR体系的优化 基于单重qPCR扩增体系，对多重qPCR的引物浓度以及探针浓度进行优化，最终筛选出最优反应条件。

新生儿窒息可以造成多种脏器的损伤，其中对脑和肾脏的损伤最为明显［1］，而对肾脏的损伤诊断最常用的指标仍为血清肌酐（creatinine，Cr）和尿素氮（urea，BUN），但二者的变化有其滞后性。尤其是对高危群体的新生儿，这两项并不能早期灵敏的指示肾小球滤过率的改变。近年来发现标胱抑素C（Cys－C）在反应肾小球滤过率上较血清Cr、BUN有更高的敏感性［2］。本研究选取Cys－C、Cr和BUN，结合其他几项常用的评价新生儿状态的指标，旨在评价Cys－C在新生儿窒息后肾脏损害早期诊断的临床价值。

2.4 多重qPCR特异性试验 按优化后的荧光PCR反应体系，分别对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌O157:H7和其它12株供试菌种进行多重qPCR检测，并设立空白对照。

2.5 多重qPCR灵敏度试验和标准曲线的建立将沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌O157:H7三种菌的重组质粒分别用无菌水10倍梯度稀释至102拷贝数/μL，各个稀释度的质粒按照2.3优化的反应条件进行多重qPCR。以重组质粒拷贝数浓度的对数值作为横坐标，以PCR反应的Ct值为纵坐标作图，绘制相对定量的标准曲线。

2.6 多重qPCR重复性试验 按照2.3优化的反应条件，以浓度为109～105拷贝数/μL的重组质粒为模板，每个浓度进行10个重复，分别计算批内变异系数（CV%）和批间变异系数。

2.7 临床样品检测 在本地3个超市购买30份生鲜肉，包括牛肉、猪肉和鸡胸肉各10份。称取样品25 g肉至拍击式均质袋，加入225 mL无菌EC肉汤，均质2 min。37℃培养箱培养18 h，取增菌液1 mL用于核酸提取，按照优化好的反应条件进行qPCR检测。同时采用国家标准（GB 4789.10-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验[8]》、GB 4789.4-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验 沙门氏菌检验[9]》、GB 4789.36-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠埃希氏菌O157:H7/NM检验》[10]）进行检测结果比对，验证多重qPCR方法的可靠性。

2.8 数据统计 采用SPSS 23.0软件对试验数据进行统计分析，试验数据以“平均值±标准差”表示。

表2 本研究用到的引物和探针

3 结果与分析

3.1 多重qPCR体系优化 对多重qPCR的引物浓度以及探针浓度进行优化，最终筛选出最优反应体系为2×Premix Ex Taq（Probe qPCR）25.5μL，三种细菌混合的上下游引物各1.5μL，混合的探针0.4μL，混合模板4μL，ddH2O补足至50μL。

3.2 多重qPCR的特异性 多重qPCR方法的特异性结果见图1。3种靶细菌显示良好的PCR扩增信号，而非靶细菌和空白对照均无特异性扩增。证明本试验所采用的引物和探针对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌O157:H7具有良好的特异性，且不会产生交叉反应。

3.3 标准曲线的建立 将制备的3种靶细菌重组阳性质粒DNA稀释至1010～105拷贝数/μL，按照已优化的反应体系及条件进行qPCR并建立标准曲线，结果表明：沙门氏菌的标准曲线线性方程为Y=-4.74X+57.046，相关系数（R2）为0.996，扩增效率为90.78%；金黄色葡萄球菌的标准曲线线性方程为Y=-4.929X+58.824，R2为0.999，扩增效率为86.72%；大肠杆菌O157:H7的标准曲线线性方程为Y=-4.277X+52.119，R2为0.997，扩增效率为84.86%（见图2）。R2均大于0.99，表明DNA拷贝数浓度的对数值与Ct值之间具有良好的线性关系。表明设计的引物和探针具有较高的扩增效率，所建立的多重qPCR结果准确可靠。

图1 多重qPCR扩增结果

图2 多重荧光PCR标准曲线分析

3.4 qPCR灵敏度试验 用106～102拷贝数/μL的沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌O157:H7质粒进行灵敏度检验，阳性结果判断以35个循环为限。由图3可知，金黄色葡萄球菌和沙门氏菌灵敏度为105拷贝数/μL，而大肠杆菌O157:H7灵敏度为104拷贝数/μL。

图3 3种食源性致病菌的灵敏度试验

3.5 多重qPCR重复性检验 5个梯度批内变异系数处在0.12%～1.71%，小于5%（见表3），批间变异系数处在0.05%～6.62%，小于15%～20%（见表4），表明重复性较好。

3.6 临床样品检测 应用已建立的多重qPCR方法对30份样品中进行大肠杆菌O157:H7、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌检测，结果表明大肠杆菌O157:H7、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的检出率分别为23.3%（7/30）、10%（3/30）、13.3%（4/30）。传统培养法检测样品中大肠杆菌O157:H7和金黄色葡萄球菌的 检 出 率 分 别 为20%（6/30）、10%（3/30）、10%（3/30）。用qPCR方法检测大肠杆菌O157:H7、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的检出率略高于传统培养法，所需的检测时间较国标法明显缩短。表明所建立的qPCR方法可特异、快速地实现对生鲜肉中大肠杆菌O157:H7、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的检测。

表3 多重qPCR批内重复性检验

表4 多重qPCR批间重复性检验

表5 qPCR方法与国标法检测样品比对

4 讨 论

生鲜的畜禽产品从生产到餐桌中间涉及到多个环节，因而极其容易受到病原菌的污染。传统的细菌培养法需要经过增殖培养、选择性培养和生化鉴定三个步骤才能得出结果，被认为是检测食源性致病菌的“金标准”，但是该方法通常需要5～6 d才能得出结果[11]，无法进行定量分析，检测灵敏度低[12]。食品中污染食源性致病菌的剂量往往很低。因此，传统的细菌培养法不能完全用于食源性致病菌的检测。而基于核酸检测的分子生物学方法，如qPCR具有灵敏度高、特异性强且能够进行高通量分析等优点，已广泛应用于食源性致病菌的检测[13-16]。

在多重qPCR反应中，扩增结果的特异性取决于引物设计，而特异性靶基因的选择又决定了引物设计的准确性，因此，选用的靶基因最好在目标菌中高度保守。在本试验中选用的3种病原菌的靶基因分别为沙门氏菌吸附和侵袭上皮细胞表面蛋白的编码基因invA、金黄色葡萄球菌编码耐热核酸酶基因nuc、大肠杆菌O157:H7编码O抗原翻转酶基因wzx。invA基因已被证明是沙门氏菌的特异性基因[17]。nuc基因是金黄色葡萄球菌的高度保守序列，特异性强，大量的文献也选用该基因作为金黄色葡萄球菌特异性靶基因[3,14,17-18]。wzx基因也常被用作大肠杆菌O157的靶基因[19]。本研究设计的3对特异性引物和探针，优化后的多重qPCR能对靶细菌的单一或混合基因组DNA进行特异性扩增，对其它13株菌株的基因组DNA则无扩增，表明本试验所建立的qPCR方法特异性强。

为了验证所建立多重qPCR方法在实际中检测样品的可行性，本研究用建立的新方法检测30份生鲜肉，同时采用国标法进行比对验证。结果表明，应用传统培养法检测大肠杆菌O157:H7和金黄色葡萄球菌的检出率略低于qPCR方法。有文献也报道了类似的结果[16,20-22]。由于传统培养法检测的是能在培养基上生长的活菌落，而qPCR方法检测的是病原菌的核酸，无法区分死菌和活菌[16,22]。此外，有些细菌处于休眠状态但无法培养生长[23]。因此，与国标法相比，qPCR方法会出现假阳性结果。

综上，本研究针对大肠杆菌O157:H7、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌建立的多重qPCR方法具有特异性强、检测迅速等优点，可为生鲜肉中3种食源性致病菌检测提供一种快速、准确的检测手段。