不同孵化方式对仔鸡盲肠菌群多样性的影响

陈晓蕾 陈 荣 黄瑞玲 许丽惠 福建农林大学动物科学学院（蜂学学院） 福州 350002

肠道中存在数量巨大、种类复杂的细菌，它们参与宿主对营养物质的消化、吸收和代谢，影响外来致病菌在肠道内定植，调节免疫系统，保护宿主健康，提高其生产力[1]，异常的微生物群落发育可改变肠道微生物的定植，导致过敏、胃肠道疾病、肥胖、糖尿病和免疫系统发育改变等[2]。

孵化是禽类繁殖活动的一种特殊方式，分为孵化机孵化和母鸡孵化。孵化机孵化相比于母鸡孵化而言，可以降低母鸡的就巢性，缩短母鸡的就巢时间，减少母鸡的体力消耗，提高产蛋率、孵化率和雏鸡成活率，人工孵化技术在养鸡业上大大提高了生产效率[3]。

最新研究表明，分娩方式是影响新生儿在婴儿期肠道菌群组成的一个重要因素，刚出生的婴儿很快就会受到来自母亲和周围环境微生物的定植，儿童期和生命后期的疾病可能是由婴儿期肠道菌群的定植扰乱所干预的。在哺乳动物中，顺产的新生动物出生时立即被暴露于产道，剖腹产的幼畜则由于没有通过产道导致其肠道菌群多样性发生了改变[4]。由蛋孵化出生的动物与哺乳动物有很大不同，但它们具有新生儿几乎立即暴露在母体微生物菌群的共同特点。母鸡孵化的仔鸡最早是与蛋壳表面和巢穴周围环境的细菌接触，其肠道菌群与此有关，但是该过程仔鸡容易感染母鸡生殖系统内的致病菌。机器孵化通常要对蛋进行清洗和熏蒸，从而达到灭菌的效果，因此，孵化机孵化的仔鸡出壳后最先接触到的是孵化机内的环境[5]，可以减少新生仔鸡接触病原菌。

肠道微生物种类繁多，通过传统测序法很难全面了解肠道菌群的组成，近年来，高通量测序技术分析微生物群落得到了快速的发展，大量有关肠道微生物群落的研究取得了新进展[6]。本研究选择母鸡孵化和孵化机孵化两种孵化方式，分别采集仔鸡出壳前1 d、出壳后7 d和14 d的盲肠内容物，从中提取基因组DNA，进行Illumina-Miseq高通量测序，分析不同孵化方式对新生仔鸡盲肠微生物多样性的影响，研究结果对于改善仔鸡肠道健康和提高商品鸡生产性能提供重要的基础数据。

1 材料与方法

1.1 试验动物 8羽健康母鸡，以及所产的54枚种蛋，由福建某鸡场提供。

1.2 方法

1.2.1 试验分组 种蛋随机分为两组，J组采用孵化机孵化，M组采用母鸡自然孵化，分别在出壳前1 d和出壳后7 d、14 d随机选择3枚蛋或鸡采集盲肠内容物，分别命名为J0、J1、J2和M0、M1、M2。

1.2.2 孵化与采集样本 两组蛋同一天开始孵化，6 d后进行照蛋，观察胚胎发育是否正常，挑出无精蛋和死精蛋；18 d时进行第二次照蛋，挑出死胚蛋，并将J组发育正常的蛋移入出雏机中；21 d时，两组各挑选3枚未破壳的蛋，在超净台内采集盲肠，立即放置-80℃冰箱中保存。仔鸡孵出后全程单笼饲养，饲养环境、饲养营养和管理均保持一致，分别在出壳后7 d、14 d随机选择3羽鸡，在超净台内采集盲肠内容物，充分混合均匀，分装入提前灭菌好的离心管中，将采集的样品送至上海美吉生物医药科技有限公司进行肠道菌群检测分析。

1.2.3 数据分析与处理 获得有效数据后进行OTU（Operational taxonomic units）聚类及物种分类分析，针对OTU的聚类结果，对每个样本所代表的OTU进行物种注释，进而得到对应的物种信息以及基于物种的丰度分布情况。并且分析OTU的物种丰度、物种Alpha多样性及Venn图等，获得样品中物种丰度及多样性、不同组别或不同样本间所共有的和特有的OTU信息等。

2 结 果

2.1 测序结果 J0组和M0组的有效序列数量较少；J1组平均获得65 602个有效序列，52 985个高通量序列；J2组共获得67 321个有效序列，53 814个高通量序列；M1组共获得64 122个有效序列，48 448个高通量序列；M2组共获得63 272个有效序列，42 884个高通量序列（见表1）。

表1 有效序列和高通量序列的统计结果

2.2 OTU分析

2.2.1 OTU Venn图分析 OTU Venn图（见图1），图中不同颜色的图形代表不同组别，不同颜色的图形之间交叠部分数字为不同组别共有的OTU个数。从图中可以看出，在97%的相似水平下对所有序列进行OTU划分，共产生319个OTU，4组共同拥有156个OTU，占总OTU的48.90%；J1组与M1组共产生289个OTU，共同拥有174个OTU，其中M1组独有的OTU个数较多，为96个；J2组与M2组共产生306个OTU，共同拥有184个OTU，其中M2组独有的OTU个数较多，为111个。结果表明，不同孵化方式出生的仔鸡盲肠菌群组成不同。

2.2.2 OTU PCA分析 图2为基于OTU水平的PCA，X轴为PC1，Y轴为PC2，括号内的百分比表示对样本组成差异的解释度值，X轴与Y轴的刻度是相对距离，图中各点表示各个样本，不同颜色的点代表不同组别的样本，点越接近表明样本物种组成越相似。从图中可以看出，J1组与M1组在PC1和PC2方向均存在分离，J2组与M2组的差异主要来自于PC1。

图1 OTU Venn图

图2 基于OTU水平的PCA

2.3 Alpha多样性分析 从表2和图3可以看出，J1组的Chao1指数、ACE指数和Shannon指数显著低于M1组（P＜0.05），Simpson指数显著高于M1组（P＜0.05）；J2组的Chao1指数、ACE指数和Shannon指数显著低于M2组（P＜0.05），Simpson指数显著高于M2组（P＜0.05）。其中，Chao1指数和ACE指数用于反映群落丰富度，指数值越大，表明样本中物种越丰富；Shannon指数和Simpson指数反映群落多样性，Shannon指数值越大，表明群落多样性越大，Simpson指数值越低，表明群落多样性越大。可见母鸡孵化出生的仔鸡盲肠菌群丰富度和多样性高于孵化机孵化。

表2 Alpha多样性指数分析

图3 Alpha多样性指数的稀释曲线

2.4 组间物种丰度差异分析 物种差异性检验柱状图可以直观地展示丰度均值总和较大的物种的平均相对丰度，基于物种的丰度情况，运用Welch T检验分析不同组别表现出丰度差异的物种，对P值进行FDR校正，评估差异的显著性。

2.4.1 门水平组间物种丰度差异分析 在门水平上，仔鸡盲肠内容物中主要的菌门有（见图4）：厚壁菌门（Firmicutes）、Campilobacterota、变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteriota）、拟杆菌门（Bacteroidota）。4组样品的优势菌门均为厚壁菌门，J1组厚壁菌门的丰度极显著高于M1组（P＜0.01），M1组Campilobacterota的丰度极显著高于J1组（P＜0.01）；J2组厚壁菌门的丰度显著高于M2组（P＜0.05），M2组变形菌门的丰度显著高于J2组（P＜0.05）。

2.4.2 纲水平组间物种丰度差异分析 在纲水平上，仔鸡盲肠内容物中主要的菌纲有（见图5）：梭菌纲（Clostridia）、芽孢杆菌纲（Bacilli）、Campylobacteria、γ-变 形 菌 纲（Gammaproteobacteria）、Coriobacteriia、未分类的厚壁菌门（unclassified_p__Firmicutes）、拟杆菌纲 （Bacteroidia）、放线菌纲（Actinobacteria）、厚壁菌纲（Negativicutes）。4组样品的优势菌纲均为梭菌纲，J1组梭菌纲的丰度极显著高于M1组（P＜0.01），M1组弯曲菌纲的丰度极显著高于J1组（P＜0.01）；J2组梭菌纲的丰度显著高于M2组（P＜0.05），M2组芽孢杆菌纲、γ-变形菌纲和未分类的厚壁菌纲显著高于J2组（P＜0.05）。

图4 门水平物种差异性检验柱状图

图5 纲水平物种差异性检验柱状图

2.4.3 目水平组间物种丰度差异分析 在目水平上，仔鸡盲肠内容物中主要的菌目有（见图6，仅展示丰度均值总和前15位的菌目）：毛螺菌目、颤螺菌目、梭菌_UCG-014目（Clostridia_UCG-014）、弯曲杆菌目、乳杆菌目（Lactobacillales）、丹毒丝菌目（Erysipelotrichales）、肽链球菌-组织菌目（Peptostreptococcales-Tissierellales）、肠杆菌目（Enterobacterales）、Clostridia_vadinBB60_group、单球菌目、Christensenellales、芽孢杆菌目（Bacillales）、未分类的厚壁菌。J1组乳杆菌目的丰度显著高于M1组（P＜0.05），M1组Oscillospirales、梭菌_UCG-014目 、Campylobacterales、Clostridia_vadinBB60_group、Christensenellales、芽孢杆菌目的丰度显著高于J1组（P＜0.05）；J2组乳杆菌目的丰度极显著高于M2组（P＜0.01），M2组Oscillospirales、Clostridia_UCG-014、Peptostreptococcales-Tissierellales、Clostridia_vadinBB60_group的丰度极显著高于J2组 （P＜0.01），M2组乳杆菌目、肠杆菌目、未分类的厚壁菌目的丰度显著高于J2组（P＜0.05）。

2.4.4 科水平组间物种丰度差异分析 在科水平上，仔鸡盲肠内容物中主要的菌科有（见图7，仅展示丰度均值总和前15位的菌科）：毛螺旋菌科（Lachnospiraceae）、瘤胃菌科（Ruminococcaceae）、螺杆菌科（Helicobacteracea）、norank_o__Clostridia_UCG-014、Eubacterium_coprostanoligenes_group、Oscillospiraceae、Butyricicoccaceae、乳杆菌科（Lactobacillaceae）、norank_o__Clostridia_vadinBB60_group、肠杆菌科（Enterobacteriaceae）、Christensenellaceae、Peptostreptococcaceae、Butyricicoccaceae、unclassified_o__Oscillospirales、明串珠菌科（Leuconostocaceae）。J1组毛螺旋菌科的丰度显著高于M1组（P＜0.05），M1组瘤胃菌科的丰度高于J1组（P＞0.05），norank_o__Clostridia_UCG-014、螺杆菌科、Oscillospiraceae、norank_o__Clostridia_vadinBB60_group的丰度极显著高于J1组（P＜0.01），Eubacterium_coprostanoligenes_group、Christensenellaceae的 丰 度显著高于J1组（P＜0.05）；J2组毛螺旋菌科的丰度极显著高于M2组（P＜0.01），Butyricicoccaceae的丰度显著高于M2组（P＜0.05），M2组norank_o__Clostridia_vadinBB60_group、瘤胃菌科、norank_o__Clostridia_UCG-014、Peptostreptococcaceae的丰度极显著高于J2组（P＜0.01），乳杆菌科、Oscillospiraceae、肠杆菌科、Butyricicoccaceae、unclassified_o__Oscillospirales、明串珠菌科的丰度显著高于J2组（P＜0.05）。

图7 科水平物种差异性检验柱状图

2.4.5 属水平组间物种丰度差异分析 在属水平上，仔鸡盲肠内容物中主要的菌属有（见图8，仅展示丰度均值总和前 15位 的菌属）：Ruminococcus_torques_group、粪杆菌属（Faecalibacterium）、未分类的毛螺菌科（unclassified_f__Lachnospiraceae）、norank_f__norank_o__Clostridia_UCG-014、norank_f__Eubacterium_coprostanoligenes_group、 螺杆菌属（Helicobacter）、Butyricicoccus、Eisenbergiella、乳杆菌属（Lactobacillus）、Shuttleworthia、La chnoclostridium、Blautia、Lachnoclostridium、norank_f__Ruminococcaceae、Subdoligranulum、大肠埃氏菌属-志贺氏菌属（Escherichia-Shigella）、Shuttleworthia、Lachnospiraceae_NK4A136_group。J1组Ruminococcus_torques_group、未分类的毛螺菌科、Lachnoclostridium的丰度显著高于M1组（P＜0.05），M1组粪杆菌属、norank_f__norank_o__Clostridia_UCG-014、norank_f__Eubacterium_coprostanoligenes_group、螺杆菌属的丰度显著高于J1组（P＜0.05），Shuttleworthia的丰度极显著高于J1组（P＜0.01）；J2组Ruminococcus_torques_group、未分类的毛螺菌科的丰度极显著高于M2组（P＜0.01），norank_f__Ruminococcaceae、Subdoligranulum、Butyricicoccus、Shuttleworthia的丰度显著高于M2组（P＜0.05），M2组 norank_f__norank_o__Clostridia_UCG -014、Lachnoclostridium、Lachnospiraceae_NK4A136_group的丰度极显著高于J2组（P＜0.01），粪杆菌属、乳杆菌属、Eisenbergiella、大肠埃氏菌属-志贺氏菌属的丰度显著高于J2组（P＜0.05）。

图8 属水平物种差异性检验柱状图

2.4.6 种水平组间物种丰度差异分析 在种水平上，仔鸡盲肠内容物中主要的菌种有（见图9，仅展示丰度均值总和前15位的菌种）：未培养的粪杆菌属（uncultured_bacterium_g_Faecalibacterium）、幽门螺杆菌（Helicobacter pullorum）、uncultured_bacterium_g__Ruminococcus_torques_group、unclassified_f__Lachnospiraceae、未培养的瘤胃球菌（uncultured_bacterium_g__Ruminococcus_torques_group）、unclas_sifiedg__norank_f__norank_o__Clostridia_UCG-014、uncultured_Subdoligranulum_sp、uncultured_bacterium_g__Shutt-leworthia、uncultured_organism_g__Lachnoclostridium、Escherichia_coli_g__Escherichia-Shigella。J1组unclassified_f__Lachnospiraceae、uncultured_bacteriu_mg_Ruminococcus_torques_group、uncultured_Subdol-igranulum_sp、uncultured_Clostridiales_bacterium_g__Ruminococcus_torques_group的丰度显著高于M1组（P＜0.05）；M1组unclassified_g__norank_f__norank_o__Clostridia_UCG、uncultured_bacterium_g__Shuttl-eworthia的丰度极显著高于J1组（P＜0.01），gut_met-agenome_g__norank_f__Eubacterium_coprostanolige-n es_group、幽门螺杆菌、Butyricicoccus_pullicaecorum的丰度显著高于J1组（P＜0.05）；J2组unclassified_f__Lachnospiraceae、uncultured_bacterium_g__Rumin-ococcus_torques_group、uncultured_Clostridiales_bac-terium_g__Ruminococcus_torques_group的丰度极显著高于M2组（P＜0.01），M2组uncultured_bacterium_g__Faecalibacterium、Lactobacillus_oris、unclassified_g__Lactobacillus、uncultured_bacterium_g__Eisenber-giella的丰度显著高于J2组（P＜0.05）。

图9 种水平物种差异性检验柱状图

3 讨 论

在鸡的肠道内寄生多种多样的微生物，通常称之为肠道菌群，肠道菌群在鸡体内发挥许多重要的作用，它们可以提供消化酶来源，提高营养物质的利用率；与侵入的病原菌竞争，使之无法接近肠黏膜上的附着位点；激活宿主的免疫系统，提高机体免疫防御功能。异常的肠道菌群也会表现出一些不利的方面，例如，它们与宿主竞争肠道内的营养，分泌有毒化合物，诱导炎症反应的发生，刺激上皮细胞快速更新，从而导致鸡的生长性能下降。

最新研究表明，新生动物的生产过程对其肠道菌群的多样性构成具有决定性的意义，刚出生的婴儿很快就会受到来自母亲和周围环境微生物的定植，剖腹产与自然顺产方式出生的新生哺乳动物的肠道菌群多样性不同[7]。鸡与哺乳动物不同，其通过孵化的方式出生，主要是母鸡孵化和孵化机孵化。母鸡孵化的仔鸡出壳后最先接触到的是蛋壳表面、母鸡以及窝巢周围环境；孵化机孵化之前，通常会将蛋进行清洗灭菌[8]，出壳后最先接触到的是出雏机内的环境。本研究采用两种孵化方式，即母鸡孵化和孵化机孵化，分别采集仔鸡出壳前1 d、出壳后7 d和14 d的盲肠内容物，基于高通量测序探究不同孵化方式出生的仔鸡盲肠微生物群落多样性的差异。

根据OTU Venn图分析可知，M组的OTU个数多于J组，表明不同孵化方式会影响仔鸡盲肠菌群的丰度，且母鸡孵化的仔鸡菌群丰度更高。基于OTU水平的PCA结果显示，J1组与M1组在PC1和PC2方向上差异较大，J2组与M2组的差异主要在PC1，表明不同孵化方式会影响仔鸡盲肠的物种组成。Alpha多样性分析结果显示，M1组和M2组的Chao1指数、ACE指数及Shannon指数显著高于J1组和J2组（P＜0.05），Simpson指数显著低于J1组和J2组（P＜0.05），表明采用母鸡孵化出生的仔鸡盲肠菌群丰富度和多样性大于孵化机孵化的仔鸡，推测可能是由于母鸡孵化的仔鸡出壳后最先接触的环境较为复杂，蛋壳表面以及巢穴周围环境的细菌迅速在仔鸡的肠道定植所致。

在门水平上，4组样本的核心菌门均为厚壁菌门，与张亚楠[9]和杨天龙等[10]的研究结果一致。在纲水平上，4组样本的核心菌纲均为梭菌纲，与贾福晨等[11]基于高通量测序分析鸡肠道细菌群落分布特征得出的结论一致。在目水平上，M2组的乳杆菌目和肠杆菌目的丰度显著高于J2组；高岩等[12]研究表明乳杆菌目可以调节肠道菌群的平衡，降低新生动物的腹泻率，张春宝[13]研究表明乳杆菌目可以有效抑制肠道内大肠杆菌的数量，由此推测母鸡孵化出生的小鸡在肠道菌群平衡方面优于机器孵化。在科水平上，J组的毛螺菌科相对丰度高于M组，尹振晨[14]研究表明毛螺菌科与糖类、脂类和蛋白质的代谢有关；M2组的瘤胃菌科和乳杆菌科相对丰度较高，其中瘤胃菌科是活性植物降解剂，可以降解宿主难以消化的纤维素和半纤维素[15]，母鸡孵化的仔鸡可能由于出生后的环境不同于机器孵化的仔鸡，优先定植的细菌不同，使得其肠道内的瘤胃菌科丰度较高，有利于消化饲料中的纤维素。在属水平上，M组的粪杆菌属是优势菌属，粪杆菌属是常见的产丁酸菌，产丁酸菌作为肠道的益生菌，对动物的生理机能具有重要意义[16]，而丁酸作为肠道微生物重要的代谢产物，它能够参与宿主的代谢，影响基因表达[17]；M2组的乳杆菌属丰度高于J2组，乳杆菌属是动物肠道的益生菌群，具有维持动物机体健康和免疫调节功能，其能够利用葡萄糖进行发酵并产生乙酸和乳酸等降低肠道pH，抵御外来病原菌的入侵，促进有益菌的生长繁殖，调节营养的吸收利用。在种水平上，M1组中检测出幽门螺杆菌，幽门螺杆菌感染是引起人慢性胃炎、消化性溃疡的病因之一，与胃癌以及胃黏膜相关淋巴组织淋巴癌的发生密切相关[18]；M2组中存在一定量的志贺氏菌，志贺氏菌感染会导致鸡出现痢疾、消瘦和明显的肠道病变等[19]，志贺氏菌也可以通过粪口途径感染人，最常见的症状是腹泻、发烧、呕吐、肠胃胀气等[20]，需要注意幽门螺杆菌和志贺氏菌的公共卫生安全意义。

综上所述，不同孵化方式对仔鸡盲肠微生物的多样性和丰度有显著影响，使用孵化机孵化的仔鸡盲肠内检测到的菌群均为正常菌群，而母鸡孵化的仔鸡出壳后接触到的环境较为复杂，致使仔鸡盲肠内存在部分病原菌，但也存在乳酸杆菌属、粪杆菌属等有益菌属，它们可以抵抗病原菌的定植，参与营养物质的消化、吸收和代谢。

4 结 论

本研究分析了不同孵化方式对仔鸡盲肠菌群多样性的影响，证明了孵化方式会影响肠道菌群的定植，进而影响肠道内菌群的丰度和多样性，研究结果对于改善仔鸡肠道健康和提高商品鸡生产性能具有一定参考价值。

致 谢王全溪副教授对本研究和论文进行了精心指导，并提供参考资料，特此致谢。