芬戈莫德预先给药对急性呼吸窘迫综合征大鼠肺损伤的保护作用

汪 宇 付惠玲 陈 芸

急性呼吸窘迫综合征(Acute Respiratory Distress Syndrome，ARDS)是一种以炎症肺水肿、重度低氧血症、弥漫性血管内皮细胞及肺泡上皮细胞损伤为主要特征的临床综合征[1]，虽然目前ARDS的治疗方法及管理方式都得到了很大的提升，但其病死率依然很高，超过了40%[2]。1-磷酸鞘氨醇(Sphingosine 1-phosphate，S1P)是一种广泛分布于生物体内的天然溶血磷脂，在调控细胞迁移、凋亡，炎症反应及血管通透性等过程中均起到重要的作用[3]，芬戈莫德(Fingolimod，FTY720)是人工合成的一种鞘氨醇结构类似物，在生物体内可以激活S1P受体发挥调控细胞凋亡的作用[4]。目前有研究发现FTY720预处理能够缓解肢体缺血再灌注诱导的肺损伤[5]，但FTY720预处理对ARDS肺损伤作用的相关研究鲜少报道。本次研究通过对ARDS大鼠模型给予FTY720预处理，旨在探讨S1P受体在ARDS中的作用，为ARDS的防治提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物来源

健康雄性SD大鼠30只，体重230-260g，购于中国食品药品检定研究院[许可证号：SCXK(京)2014-0013]，所有SD大鼠均饲养在中国检验检疫科学研究院屏障环境动物房[SYXK(京)2014-0033]，培育室温度20-25℃，湿度保持在65%-70%，进行人工光照(12h/昼、12h/夜)，大鼠全天自由饮水，常规饲料饲养。实验过程中均严格遵循“3R”原则。

1.2 主要试剂与仪器

FTY720(美国Selleck公司购买，100mg，批号：S500207)；超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)检测试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号20170309、20170114)；白细胞介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)检测试剂盒(北京博奥森生物技术有限公司，批号170428、170524)；BCA蛋白检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司，批号170312)；兔抗鼠B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl2相关X蛋白(Bax)、C/EBP环磷酸腺苷反应元件结合转录因子同源蛋白(CHOP)、半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-12(Caspase-12)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)、GAPDH抗体(Abcam公司购买)；i-STAT 300型血气分析仪(美国雅培公司)；FACSCalibur流式细胞仪(美国BD公司)；TDL-4台式离心机(上海安亭科学仪器厂)；Image Master VDS凝胶自动成像仪(瑞典Pharmacia公司)；BX 51型光学显微镜(日本Olympus公司)。

1.3 实验动物分组及模型制备处理

将30只SD大鼠按随机数字表法分为正常组、模型组和FTY720预处理组，每组各10只。适应性饲养5天后，FTY720预处理组大鼠给予FTY720 3mg/kg灌胃，1次/天，持续7 天，其余组大鼠给予等体积生理盐水灌胃。模型组和FTY720预处理组大鼠经尾静脉注射0.05ml/kg油酸，30min后再次注射2.5mg/kg大肠埃希菌脂多糖构建ARDS模型[6]，正常组大鼠注射等量生理盐水。所有建模大鼠全部建模成功，6h后用于各项指标检测。

1.4 样本采集和处理

构建模型后6h，利用i-STAT 300型便携式血气分析仪进行各组大鼠PaO2的测量；腹主动脉采血4ml，离心，吸取血清，用于血清蛋白含量检测；断头处死大鼠，开胸迅速取出心脏和肺，4℃生理盐水冲洗后将左肺门结扎，将4℃生理盐水从气管导管处缓慢注入右肺进行支气管肺泡灌洗，等待30s后吸出，每次注入量为2ml，注入后反复抽吸，连续灌洗3次后，收集5ml的支气管肺泡灌洗液(Bronchoalveolar Lavage Fluid，BALF)于离心管中，低温2 000 rpm离心10min后取上清液于液氮中冰冻，保存于-80℃超低温冰箱待测；取适量新鲜左上肺组织，剪碎后加入胰蛋白酶消化，过滤、离心后收集细胞悬液，用于细胞凋亡检测；另取左下肺组织用10%甲醇固定后，进行常规脱水、石腊包埋、切片，用于肺组织病理学检测；另取50mg肺组织，加入500μl NaCl溶液，于冰上研磨成匀浆，低温3 000rpm离心30min后，取上清保存于离心管中，放入液氮中迅速冷冻后保存于-80℃超低温冰箱，用于凋亡相关蛋白检测。

1.5 肺组织湿干重比值(Wet/dry Weight Ratio，W/D)计算

取左肺1/3部分切下，用温生理盐水冲洗干净之后，用滤纸将肺组织表明液体吸干，天平称重记录湿重，之后放入60℃恒温烘箱中72h至恒重后称重记为干重，计算W/D值。

1.6 BALF及血清中蛋白含量检测以及肺通透性指数(PPI)计算

根据BCA试剂盒中操作说明，分别计算BALF及血清样本中总蛋白含量，并计算PPI(BALF中总蛋白浓度/血清中总蛋白浓度)。

1.7 HE染色观察各组大鼠肺组织病理变化

取1.4中制备好的切片，经二甲苯脱蜡2次后，用从高到低的梯度乙醇透明，苏木精染色5min，盐酸分化15s，流水返蓝15min，伊红染色2min，再用从低到高的梯度乙醇脱色，二甲苯脱水透明后封片，利用Olympus光学显微镜观察肺组织病理形态学变化。参考文献[7]中方法，每只大鼠选样3张肺组织病理切片进行观察，每张切片选取10个视野，根据炎性细胞浸润程度、肺泡出血程度、肺泡水肿程度、肺间质水肿程度、肺不张程度及透明膜形成程度对肺损伤情况进行评分，每个项目4个程度，计0、1、2、3分，分数越高，肺损伤越严重。

1.8 流式细胞仪检测肺组织细胞凋亡情况

将1.4中制备好的细胞悬液浓度调整至1×106个/ml，接种于6孔板中、400μl/孔，每组设置3个复孔，1 000r/min离心5min，PBS洗涤2遍，弃上清液，加入细胞凋亡检测试剂盒中的缓冲液，混匀，再加入5μl AnnexinV/FITC、10μl PI混合均匀后，室温避光孵育15min，流式细胞仪上样检测，Cell Quest软件分析计算细胞凋亡率(AI)。重复试验3次。

1.9 BALF中SOD、MDA、IL-1β、TNF-α水平测定

取1.4中制备的BALF，严格按照相关试剂盒步骤处理后，用黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性、硫代巴比妥酸(TBA)法测定MDA水平，用酶联免疫吸附法(ELISA)法检测IL-1β、TNF-α水平。

1.10 Western blot法检测肺组织中内质网应激凋亡相关蛋白表达情况

取1.4中制备好的肺组织匀浆上清，采用Bradford调整各组蛋白浓度一致，经SDS-PAGE凝胶电泳、电转膜至甲醛预处理过的PVDF膜，密封2h，加入兔抗鼠Bax、Bcl-2、CHOP、Caspase-12、JNK、GAPDH(1∶1 000)一抗4℃孵育过夜，TBST漂洗40min，加入HRP标记的二抗(1∶500)孵育1h，TBST漂洗40min，ECL发光液将PVD膜显色，暗室曝光到X线片上，采用Imaging System软件分析各组条带灰度值，以目标蛋白与内参蛋白(GAPDH)条带吸光度值比值表示该蛋白的相对表达水平。

1.11 统计学处理

2 结 果

2.1 各组大鼠动脉PaO2、肺组织W/D值、PPI比较

三组大鼠PaO2、W/D值、PPI水平差异均有统计学意义(P<0.01)，与正常组大鼠相比，模型组大鼠PaO2降低，肺组织的W/D值、PPI升高(q均>10.645,P<0.01)，与模型组相比，FTY720预处理组大鼠PaO2升高，肺组织的W/D值、PPI降低，差异均有统计学意义(q均>6.186,P<0.01)。见表1。

表1 各组大鼠动脉PaO2、肺组织W/D值、PPI比较

2.2 各组大鼠肺组织病理结构观察及肺损伤评分

HE染色结果如图1所示，正常组大鼠肺组织结构完整，肺泡腔清晰可见，肺间质无水肿及炎性细胞浸润；模型组大鼠肺结构破坏严重，肺泡间隔严重增厚，且肺间质有明显出血和水肿，并伴随有大量炎性细胞浸润，肺泡腔内有透明膜形成；FTY720预处理组损伤介于正常组和模型组之间。三组间肺损伤评分差异有统计学意义(P<0.01)，与正常组相比，模型组肺损伤评分升高，与模型组相比，FTY720预处理组肺损伤评分降低，差异均有统计学意义(q均>12.226,P<0.01)。见表2。

注：黑色箭头位置提示炎性细胞浸润

表2 各组大鼠肺损伤评分及细胞AI情况比较

2.3 各组大鼠肺组织细胞凋亡情况

三组间肺组织细胞AI差异有统计学意义(P<0.01)。与正常组相比，模型组肺组织细胞AI升高，与模型组相比，FTY720预处理组肺组织细胞AI降低，差异有统计学意义(q均>18.517,P<0.01)。见图2，表2。

图2 各组大鼠肺组织细胞凋亡流式细胞仪检测结果

2.4 各组大鼠BALF中SOD、MDA、IL-1β和TNF-α水平比较

各组大鼠BALF中SOD、MDA、IL-1β和TNF-α水平差异有统计学意义(P<0.01)。与正常组相比，模型组BALF中MDA、IL-1β、TNF-α水平升高，SOD活性降低；与模型组相比，FTY720预处理组BALF中MDA、IL-1β、TNF-α水平降低，SOD活性升高，差异均有统计学意义(q均>5.302,P<0.01)。见表3。

2.5 各组大鼠肺组织中Bax、Bcl-2、CHOP、Caspase-12、JNK蛋白表达水平

Western Blot检测结果显示：各组大鼠肺组织中Bax、Bcl-2、CHOP、Caspase-12、JNK蛋白表达水平差异有统计学意义(P<0.01)。与正常组大鼠相比，模型组大鼠肺组织中Bax、CHOP、Caspase-12、JNK蛋白表达水平及Bax/Bcl-2比值显著升高，

表3 各组BALF中SOD、MDA、IL-1β、TNF-α水平比较

Bcl-2蛋白表达水平降低(P<0.01)，与模型组大鼠相比，FTY720预处理组大鼠肺组织中Bax、CHOP、Caspase-12、JNK蛋白表达水平及Bax/Bcl-2比值显著降低，Bcl-2蛋白表达水平升高(P<0.01)。见图3。

注：与正常组相比，*P<0.05；与模型组相比，#P<0.05

3 讨 论

ARDS作为临床较为常见的一种急性低氧性呼吸功能不全疾病，病死率极高，目前尚未完全阐明其具体的发病机制及病理生理过程，因此通过建立ARDS病理模型对其进行相关的实验研究至关重要[8]。“二次打击”模型是目前较为理想的一种模拟人类ARDS过程的模型，油酸注射及内毒素诱导的ARDS是主要的ARDS模型构型方式：油酸注射导致肺血管通透性增加，从而引起肺水肿[9]；内毒素诱导则主要是引起肺组织炎症反应[10]。本次研究通过油酸注射联合大肠埃希菌脂多糖来构建ARDS模型，发现模型组大鼠PaO2显著降低，同时W/D值、PPI显著升高，BALF中MDA、TNF-α、IL-1β水平显著升高，而SOD活性显著降低，肺组织病理切片结果发现，肺组织结构破坏明显，肺间质水肿、出血，并可见大量炎性细胞浸润，表明油酸注射联合大肠埃希菌脂多糖既可以对血管内皮细胞造成直接毒害作用，还会加重肺组织中炎症反应和氧化应激，促使ARDS形成。FTY720是人工合成的一类S1P受体激动剂，而S1P在细胞增殖、迁徙，细胞内Ca2+释放、血管生成及维持血管内皮屏障过程中发挥着重要的作用[11]。对ARDS模型大鼠给予FTY720预处理发现，与模型组比较其股动脉血中PaO2显著升高，BALF中MDA、TNF-α、IL-1β水平显著降低，而SOD活性显著升高，同时W/D值、PPI也显著降低，病理切片结果也显示肺组织损伤情况要显著降低，表明FTY720预处理可以保护ARDS引起的肺损伤。

ARDS会引起肺组织缺血、缺氧，引起大量氧自由基合成，这些因素均会激活内质网凋亡途径，导致细胞死亡[12]。CHOP和Caspase-12是内质网诱导细胞凋亡信号转导途径中的重要作用元件，CHOP作为内质网应激的标记分子，其表达水平升高后，能够诱导促凋亡蛋白Bax合成，抑制抗凋亡蛋白Bcl-2合成，Bax/Bcl-2比值升高，进而诱导细胞凋亡[13]；Caspase-12作为内质网应激途径特有的前凋亡分子，当机体发生内质网应激时，无活性pro-Caspase-12会迅速被激活，促进下游凋亡执行蛋白Caspase-3表达，从而诱导非线粒体依赖途径的细胞凋亡[14]。JJNK信号途径能够被多种细胞外应激原激活，从而调控细胞凋亡过程，当机体组织或细胞出现严重内质网凋亡时，TNF受体相关因子1会和活化的Ire1形成复合体，募集凋亡信号调节激酶1激活JNK信号通路，促进Bax表达，并破坏内质网膜的完整性，继而引起细胞凋亡[15]。本研究结果显示，ARDS模型大鼠肺组织细胞凋亡率显著升高，且Bax、CHOP、Csapase-12、JKN蛋白表水平及Bax/Bcl-2比值均显著升高，Bcl-2表达水平显著降低，FTY720预处理后ARDS模型大鼠肺组织细胞的凋亡率降低，且Bax、CHOP、Csapase-12、JKN蛋白表水平及Bax/Bcl-2比值均显著减低，Bcl-2表达水平升高，提示FTY720可能通过抑制内质网应激过程，降低肺血管通透性，缓解肺组的炎症反应及氧化应激，减少细胞凋亡，从而降低肺损伤。金立达等[16]研究发现，用FTY720预处理能够激动S1P1型受体，减轻肺组织炎症反应，抑制细胞凋亡减轻呼吸机引发的肺损伤，与本研究结果一致。

综上所述，FTY720预处理能够有效缓解ARDS引起的肺损伤，并可能是通过抑制内质网应激过程，降低肺血管通透性，缓解肺组织炎症反应及氧化应激，减少细胞凋亡来完成的。虽然本研究发现FTY720预处理对内质网应激有抑制作用，但FTY720是否能够通过其它途径来保护ARDS引起的肺损伤尚不清楚，有待深入研究。

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