索罗金小球藻异养转自养过程中基因表达的全局调控

祝棉棉 赵 亮 张 虎 王红霞 胡 强 韩丹翔

(1. 中国科学院水生生物研究所微藻生物能源与生物技术研发中心, 武汉 430072; 2. 中国科学院大学, 北京 100049)

近年来, 富含蛋白质的微藻作为可持续供应的食品和饲料原料引起全球的广泛关注[1]。小球藻(Chlorellaspp.)是一类单细胞真核绿藻, 普遍生长快, 蛋白质含量高, 同时含有多糖和维生素等多种营养活性成分[2,3], 在人类健康和动物营养领域具有广泛的应用前景[4,5]。小球藻兼具光合自养、异养和混养三种营养方式[6,7], 目前商业化的小球藻粉主要是采用异养培养方式生产获得。与传统光自养培养模式相比较, 微藻异养培养具有诸多优势。首先, 微藻异养培养时细胞生长速度快, 且不受光限制, 因此最终能够达到较高的细胞密度。其次, 异养培养微藻一直处于无菌的培养环境中且培养条件高度可控, 更加有利于规模化生产高品质的微藻生物质和其他产品[8]。

索罗金小球藻(Chlorella sorokiniana)广泛分布于淡水环境, 具有生长快速且能够直接食用等特点,可用于规模化培养生产生物质、油脂等大宗原料[9]。前期我们分离得到一株索罗金小球藻C. sorokinianaGT-1, 并对其异养发酵工艺进行了优化, 发现该小球藻在发酵罐中异养培养最高细胞密度可达到220 g/L[9]。然而, 在异养培养下该小球藻蛋白质含量显著低于光自养藻细胞, 对小球藻藻粉的品质造成较大的影响。

大量研究表明微藻的代谢网络和生化组成具有极强的可塑性, 因此采用多种培养模式联用可以发挥不同培养方式的优势, 从而同时实现生物质的高产和目标产物的积累。例如, Hata等[10]异养培养雨生红球藻(Haematococcus pluvialisin)达到高细胞浓度后, 通过光自养培养诱导虾青素的积累。Zheng等[11]采用异养-自养耦联的混合培养模式提高了索罗金小球藻的生物量和油脂产量。Li等[12]通过异养发酵-藻液稀释-光诱导串联培养技术提高了小球藻细胞内叶黄素的含量。尽管采用不同的培养模式来调控小球藻生化组成的技术手段被广泛应用,但是其背后的生物学过程还有待深入的研究。

随着组学分析方法的发展, 国内外研究者鉴定了多个在异养自养转化过程中发生显著变化的关键代谢物及其相关代谢途径。例如, Wu等[13]通过代谢组分析发现, 当索罗金小球藻从异养转入高光缺氮的条件时, 细胞内的糖酵解、氧化戊糖磷酸化及三羧酸循环等途径显著增强。这些途径的增强能够直接为油脂的积累提供前体化合物和还原能。Roth等[14]用转录组学的方法揭示了佐夫色绿藻(Chromochloris zofingiensis)从自养转异养的过程中在基因表达水平发生的变化, 为理解佐夫色绿藻在异养条件下积累大量的类胡萝卜素和油脂提供了基础。

另外, 多组学分析还可以服务于潜在代谢工程靶基因的鉴定, 为开发新的微藻藻种资源提供了基础。例如, Liu等[15]运用多组学分析工具揭示了佐夫氏球藻在缺氮条件下积累三酰甘油(Triacylglycerol, TAG)是多个生物学过程协同作用的结果, 并且鉴定出2个三磷酸酰基转移酶作为后续功能验证的靶标基因, 最终确定叶绿体外的三磷酸酰基转移酶在TAG生物合成过程中发挥了至关重要的功能。Ge等[16]对缺氮条件下的三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)进行蛋白组学分析, 细胞内与支链氨基酸分解代谢、糖酵解及油脂代谢相关蛋白均有显著变化, 将支链氨基酸分解途径中上调最显著的mcc2基因进行敲将后, TAG合成途径减弱并且生物量下降, 为后续产油微藻优化提供了潜在靶基因。

本研究发现C. sorokinianaGT-1在异养培养条件下蛋白质含量仅为细胞干重的35%左右, 但是该藻株在异养转自养后蛋白质含量显著提高。为了揭示索罗金小球藻在营养转换过程中代谢网络的调控方式, 通过转录测序分析了异养转自养过程中C. sorokinianaGT-1中主要涉及碳、氮代谢基因的表达全局变化, 为后续培养条件的优化及选择合适的靶基因对进行代谢工程改造以提高蛋白质含量提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 藻种与培养条件

本实验选用索罗金小球藻C. sorokinianaGT-1,来自中国科学院水生生物研究所微藻生物能源与生物技术研发中心。异养摇瓶培养选用改良后的Endo培养基[13], 置于500 mL三角瓶(装液量350 mL)中避光培养, 转速180 r/min, 培养温度为30℃。异养摇瓶培养至第4天后, 离心收集藻细胞(离心力2000×g, 2min, 室温), 并用BG11培养基进行漂洗(离心力2000×g, 2min, 室温)1次, 以0.2 g/L的初始接种浓度分别转接到自养组培养基和自养对照组培养基中。自养组培养基选用BG11培养基[17], 置于柱状光生物反应器(φ=5 cm, 装液量600 mL)中, 在24h连续光照100 μmol/(m2·s)下培养, 培养温度为(26±2)℃, 通含有2%(v/v)CO2的压缩空气。异养对照组培养基选用BG11培养基加入3 g/L葡萄糖, 置于光生物反应器(φ=5 cm, 装液量600 mL), 培养温度为(26±2)℃, 避光, 通压缩空气。

1.2 蛋白质含量的测定

改良的Bradford法[18]：称取10 mg冷冻干燥的藻粉(每个样品称取两份平行), 加入100 μL 1 mol/L NaOH, 振荡混匀后, 80℃水浴10min; 在水浴结束后, 将样品置于冰上, 再依次加入0.9 mL水, 16000×g离心10min, 收集上清。再次往沉淀中加入100 μL 1 mol/L NaOH, 并重复提取2次, 合并3次提取的上清。为了最大程度减少系统误差, 本研究将1 mL配制好的3 mg/mL蛋白标品溶液进行冷冻干燥得到的固体蛋白作为标准品, 同样用100 μL 1 mol/L NaOH溶解, 再用0.1 mol/L 的NaOH稀释成不同浓度的标准品用于绘制标准曲线。取100 μL稀释后的上清和各浓度梯度的蛋白标品依次加入1 mL Bradford工作液, 颠倒混匀; 在室温下反应10min后, 以标准曲线的0号做空白对照, 在分光光度计上测各管的A595值; 以标样组各管A595值的平均值为纵坐标, 对应蛋白质浓度为横坐标, 在Microsoft Excel软件中绘制标准曲线。根据2个相同样品稀释液A595值的平均值, 在标准曲线上计算出该样品经过稀释后的蛋白质浓度, 再由稀释倍数计算原样品蛋白质浓度。

1.3 用于转录组分析的样品准备及总RNA的提取

将小球藻异养摇瓶培养至第4天, 离心收集藻细胞(离心力2000×g, 室温), 并用BG11培养基进行漂洗(离心力2000×g, 2min, 室温)1次, 以0.2 g/L的初始接种浓度分别转接到自养组培养基和异养对照组培养基中, 各3个生物学平行, 在12h、24h、48h和72h四个时间点分别取样后, 离心收集藻细胞, 用PBS(K2HPO47 g/L, KH2PO43 g/L, NaCl 0.5 g/L,4℃, pH 7.4)进行漂洗(离心力2000×g, 2min, 4℃)1次, 离心弃去上清, 置于–80℃保存。按照TRIzol®Reagent提取试剂盒(Invitrogen, 美国)操作说明进行总RNA抽提, 并进行电泳质检。

1.4 文库的构建及测序

提取样品总RNA并用DNase I(NEB, 美国)消化DNA后, 使用文库试剂盒(NEB, 美国)提供的带有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA; 在PCR仪中94℃孵育10min, 将mRNA打断成短片段; 以打断后的mRNA为模板通过反转录酶(NEB, 美国)合成一链cDNA, 然后配制二链合成反应体系合成二链cDNA。随后分别进行纯化回收、末端修复、连接接头、片段筛选和PCR 扩增; 构建好的文库用Nano-Drop 8000(Thermo Scientific, 美国)质检, 合格后使用HiSeq 2500测序仪(Illumina, 美国)进行测序。

1.5 数据预处理及de novo拼接

通过Trimmomatic(version 0.35)对获得的33881432个raw reads进行去除接头、不确定碱基及低质量的碱基等操作后, 获得32864692个clean reads[19]。利用Trinity(version 2.5.1)软件对clean reads进行组装和质量评估[20], 其中一个基因最长的转录本视为一个Unigene。通过Trinotate (https://github.com/Trinotate/Trinotate.github.io.wiki.git)将组装得到的Unigene分别于NR、NT、Swiss-Prot、KEGG、COG及GO等数据库中进行比对和注释[21]。

1.6 数据分析

通过Salmon基于唯一映射的reads的数量对RNA-seq数据中的转录本丰度进行了量化, 并将其标准化为TPM(Transcripts per million transcripts)[22]。Bioconductor packages DESeq2鉴定表达谱中差异表达转录本和聚类转录本[23]。最后采用差值倍数log2FC(Fold change, FC)和错误发现率(False discovery rate, FDR)假设检验筛选显著差异基因。利用ggplot2 R包, 根据差异表达基因在每个样品里的表达量(TPM值), 取以2为底的对数后, 计算欧氏距离, 进行系统聚类法。并应用超几何分布检验对差异表达基因进行GO和 Pathway功能分析[24]。

2 结果

2.1 C. sorokiniana GT-1异养转自养后蛋白质含量提高

C. sorokinianaGT-1能够在异养培养条件下快速生长, 在摇瓶培养第5天即可达到生长平台期, 最高细胞浓度可达到8.185 g/L(图 1A), 但是在整个培养过程中蛋白质含量仅为细胞干重的35%左右(图 1B)。将异养培养4d的小球藻转入光自养培养条件后, 藻细胞生长速度明显放缓, 培养8d细胞干重为0.7 g/L, 显著低于同期的异养培养对照(图 1C)。蛋白质定量分析结果表明, 培养4d的异养细胞转入光自养条件下1d后, 蛋白质含量由33.63%提高至47.56%, 比同期的异养对照细胞(33.56%)提高了41.72%(图 1D)。此后, 蛋白质含量维持在最高水平, 于异养转自养的第3天后逐渐下降到36.44%。与此同时异养对照培养的细胞蛋白质含量无明显变化, 一直维持在35%左右。

图 1 小球藻在异养与自养条件下的生长及蛋白质含量的变化Fig. 1 The growth and protein contents of the Chlorella sorokiniana GT-1 cells under heterotrophic and photoautotrophic conditions

2.2 转录组序列拼接和组装

小球藻转录组测序后进行序列拼接和组装, 对转录本进行聚类去冗余后得到72818个Unigene, 总长度、N50、平均长度和GC含量分别为55.214142 M、954 bp、659.28 bp和66.13% (表 1)。通过 BUSCO软件将转录本拼接结果与OrthoDB 数据库中几个大的进化分支的单拷贝基因集进行比较, 根据比对上的比例和完整性来评价拼接组装结果的准确性和完整性。如表 1显示, 全转录组中能够完全被覆盖的基因占总数的77.3%(包括50.2%的单拷贝基因,27.1%的多拷贝基因), 覆盖不完全的基因占总基因数的9.5%, 没有任何比对结果的基因占基因总数的13.2%。上述结果表明组装的质量较好, 转录组数据可以用于下一步研究。

表 1 小球藻转录组序列组装信息和质量评估Tab. 1 Assembly statistics and assessment of transcriptome quality in de novo assembly of Chlorella sorokiniana GT-1

2.3 差异表达基因宏观分析

如图 2A所示, 12h、24h、48h和72h四个比较组样本(即不同时间点下自养组比异养对照组样本)分别检测到11256、11299、11795和11049个基因, 其中有9244个共有基因, 4个比较组样本分别有366、397、257和411个特有基因。根据基因表达的差异倍数(log2FC)大于等于1.5,P-value(Student’st-test)小于等于0.001为标准, 通过火山图可筛选显著差异表达基因。如图 2B所示, 12h、24h、48h和72h四个比较组样本分别筛选到1305(其中上调854个, 下调451个)、3571(上调1839个, 下调1732个)、3745(上调1789个, 下调1956个)和1314(上调851个, 下调463个)个显著差异表达基因。这一结果表明在C. sorokinianaGT-1异养转自养的过程中, 基因表达水平发生了全局的显著变化。

图 2 小球藻在异养转自养后12h、24h、48h、72h四个比较组样本差异基因韦恩图(A)及差异基因火山图(B)Fig. 2 Venn map (A) and volcanic map (B) for the differential expressed genes in 12h, 24h, 48h and 72h groups of Chlorella sorokiniana GT-1 during the transition from heterotrophic to photoautotrophic culturing conditions

2.4 差异基因GO与KEGG分类

对12h、24h、48h和72h四个比较组样本的差异基因进行GO功能分类注释(图 3)和KEGG功能分类注释(图 4)。GO数据库二级条目统计结果显示,12h、24h、48h和72h四个比较组样本的差异基因分别注释上711、1155、1060和592种功能。对4个比较组差异基因进行KEGG代谢通路数据库比对和注释, 分别注释上91条、115条、106条和73条代谢途径, 其中有关糖代谢、氨基酸代谢、辅因子和维生素代谢、能量代谢、核苷酸代谢及油脂代谢的差异基因较多, 而其他有关细胞过程、环境信息加工和组织系统的差异基因相对较少。

2.5 重要代谢通路分析

中心碳代谢糖酵解途径(Glycolysis)是指1分子葡萄糖生成2分子丙酮酸(Pyruvate), 并产生2分子ATP和2分子NADH的过程, 该途径分为“准备阶段”和“放能阶段”：在准备阶段, 葡萄糖经过磷酸化和异构化裂解为甘油醛-3-磷酸(Glyceraldehyde 3-phosphate, G3P); 在放能阶段, 甘油醛-3-磷酸在一系列酶的作用下形成丙酮酸, 并产生NADH和ATP[25]。为探究小球藻异养转自养过程中糖酵解途径相关酶编码基因的变化, 绘制了富集在该途径上的差异基因的动态变化(图 5A)。醛糖1-差向(异构)酶(Aldose 1-epimerase, GALM)、葡萄糖-6-磷酸差向异构酶(Glucose-6-phosphate 1-epimerase,GPE)和果糖激酶(Fructokinase, FK)的编码基因在转入自养条件下12h均无变化, 24h后开始持续上调,其中果糖激酶的编码基因自养24h和48h均上调了300%(P≤0.001)。催化果糖-6-磷酸(Fructose-6-phosphate)生成果糖-1, 6-二磷酸(Fructose-1,6-phosphate)的磷酸果糖激酶(Phosphofructokinase, PFK)在异养转自养后快速上调, 之后24h下调了110%倍(P≤0.001), 然后继续上调。在糖酵解途径的放能阶段, 甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GPDH)能够催化甘油醛-3-磷酸(Glyceraldehyde-3-phosphate)氧化脱氢, 生成高能磷酸化合物即甘油酸-1, 3-二磷酸(Glycerate-1,3-phosphate)[25]。如图 5A所示, 甘油醛-3-磷酸脱氢酶的编码基因在转入自养条件下72h前没有变化,而在72h上调250%(P≤0.001)。另外, 催化磷酸烯醇式丙酮酸(Phosphoenolpyruvate)转化为丙酮酸的丙酮酸激酶(Pyruvate kinase, PK)在异养转自养过程中持续上调。综上所述, 在C. sorokinianaGT-1异养转自养后, 糖酵解途径上调, 生成大量的丙酮酸, 并为机体提供了还原能。糖酵解途径生成的丙酮酸在有氧条件下会进入三羧酸循环(Tricarboxylic acid cycle, TCA cycle), 三羧酸循环的中间产物可以作为其他物质合成的碳骨架来源[26]。如图5A所示, 三羧酸循环途径相关酶的编码基因在转入自养条件均下调。

图 3 小球藻在异养转自养后12h、24h、48h和72h四个比较组样本差异基因的GO功能分类Fig. 3 GO functional classification of differential expressed genes in 12h, 24h, 48h and 72h of groups of Chlorella sorokiniana GT-1 during the transition from heterotrophic to photoautotrophic culturing conditions

除了糖酵解途径以外, 1分子葡萄糖还可以在磷酸戊糖途径(Pentose Phosphate Pathway)中进行氧化分解, 并且产生12个具有强还原力的NADPH分子[27]。该途径分为氧化阶段和非氧化阶段。在氧化阶段, 葡萄糖-6-磷酸(Glucose-6-phosphate)经过2次脱氢生成核酮糖5磷酸(Ribulose-5-Phosphate),同时生成NADPH[27]。如图 5B所示, 6-磷酸葡萄糖脱氢酶(Glucose-6-phosphate dehydrogenase, G6PDH)和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6-phosphogluconate dehydrogenase, PGDH)在转入自养条件后持续上调,并且在自养48h分别上调200%和160%(P≤0.001);而6-磷酸葡萄糖酸内酯酶(6-phosphogluconolactonase, PGLS)在转入自养条件后略微下调, 在自养48h时开始轻微上调64%(P≤0.001)。在非氧化阶段, 核酮糖5磷酸通过一系列反应形成果糖-6-磷酸和甘油醛-3-磷酸, 将磷酸戊糖途径与糖酵解途径联系起来[27]。如图 5B所示, 核酮糖-磷酸异构酶(Ribulose-phosphate 3-epimerase, RPE)及核糖-磷酸异构酶(Ribose 5-phosphate isomerase, RPI)的编码基因均有2个拷贝, 其中核糖-磷酸异构酶的编码基因在异养转自养过程中持续下调, 并在自养48h下调320%(P≤0.001); 核酮糖-磷酸异构酶的编码基因在转入自养条件后均下调, 其中1个拷贝在转入自养24h时有轻微上调后。转酮醇酶(Transketolase,TKT)的编码基因在转入自养条件后持续下调。转醛醇酶(Transaldolase, TAL)的编码基因有3个拷贝,其中1个在转入自养条件后持续下调, 在自养48h下调了170%(P≤0.001); 另外在异养转自养过程中持续上调, 在自养24h分别上调了230%和450%(P≤0.001)。这说明C. sorokinianaGT-1异养转自养后磷酸戊糖途径的氧化阶段在转录水平上调而非氧化阶段在转录水平下调。

图 4 小球藻在异养转自养后12h、24h、48h和72h四个比较组样本差异基因的KEGG功能分类Fig. 4 KEGG functional classification of differential expressed genes in 12h, 24h, 48h and 72h of groups of Chlorella sorokiniana GT-1 during the transition from heterotrophic to photoautotrophic culturing conditions

主要氮代谢和尿素循环氮代谢(Nitrogen metabolism)主要是氮的吸收、同化和再利用等过程[28]。硝酸盐转运蛋白(Nitrate transporter, NRT)首先将胞外硝酸盐转运至胞内, 使其被还原为NH4+[28]。如图 6A所示, 硝酸盐转运蛋白的编码基因在转入自养条件下先下调再上调, 自养24h时下调220%,自养72h时上调160%(P≤0.001), 说明小球藻在自养一段时间后开始大量转运培养基中的硝酸盐, 用于自身氮同化。谷氨酸合成酶(Glutamate synthase,GOGAT)和谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthetase,GS)途径是NH4+同化过程中非常重要的酶[29,30]。如图 6A所示, 在谷氨酸合成酶的编码基因中, 依赖NADH的谷氨酸合成酶在转入自养条件下48h上调180%(P≤0.001)而依赖Ferredoxin的谷氨酸合成酶在转入自养条件下24h下调180%(P≤0.001)。除此之外, 在维持细胞内的C/N平衡中发挥着关键作用的谷氨酸脱氢酶(Glutamate dehydrogenase, GDH)在转入自养条件下瞬时上调180%(P≤0.001, 图 6A)。尿素循环(Urea cycle)是多余的氨从细胞内排出的一条途径[29], 该途径相关酶的编码基因在异养转自养过程中均是持续下调(图 6A)。这说明C. sorokinianaGT-1异养转自养后氮代谢增强, 并且谷氨酸脱氢酶的编码基因上调以维持细胞内C/N平衡。同时, 我们也观察到异养转自养后尿素循环途径在转录水平普遍减弱(图 6B)。

图 5 中心碳代谢途径在异养转自养过程中转录水平的倍数变化Fig. 5 Fold-changes of the transcripts involved in the central carbon metabolism during the transition from heterotrophic to photoautotrophic culturing conditions

氨基酸的生物合成途径三羧酸循环的中间产物α-酮戊二酸(α-ketoglutarate)转化为谷氨酸(Glutamate)后通过特定途径可以合成鸟氨酸(Ornithine)、精氨酸(Arginine)、脯氨酸(Proline)及羟脯氨酸(4-hydoxyproline)。转录组分析显示鸟氨酸合成途径中θ-1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(Delta-1-pyrroline-5-carboxylate synthetase, P5CS)的编码基因转入自养条件下略微下调后持续上调, 鸟氨酸-氧酸转氨酶(Ornithine-oxo-acid transaminase, OAT)的编码基因转入自养条件下下调, 自养24h下调170%(P≤0.001), 而自养72h后上调230%(P≤0.001)。脯氨酸合成途径中脯氨酸4-羟化酶(Prolyl 4-hydroxylase, P4HA)的编码基因在C. sorokinianaGT-1异养转自养过程中持续上调, 分别在自养12h上调100%和自养48h上调120%(P≤0.001; 图 7)。糖酵解途径的产物丙酮酸可以作为异亮氨酸(Isoleucine)、缬氨酸(Valine)和亮氨酸(Leucine)合成途径的共同碳骨架来源。转录组分析显示丙酮酸族氨基酸合成途径相关酶的编码基因在转入自养条件下前24h均下调, 而在48h后开始持续上调(图 7)。

图 6 氮代谢与尿素循环途径在异养转自养过程中转录水平的倍数变化Fig. 6 Fold-changes of the transcripts involved in the nitrogen metabolism and urea cycle during the transition from heterotrophic to photoautotrophic culturing conditions

此外, 三羧酸循环的中间产物草酰乙酸(Oxaloacetate)转化为天冬氨酸(Aspartate)后通过一系列反应可以合成天冬酰胺(Asparagine)、赖氨酸(Lysine)、高丝氨酸(Homoserine)、苏氨酸(Threonine)、高半胱氨酸(Homocysteine)和甲硫氨酸(Methionine)。糖酵解途径的中间产物磷酸烯醇式丙酮酸和磷酸戊糖途径的中间产物赤藓糖-4-磷酸(Erythrose-4-phosphate)能够生成莽草酸(Shikimate), 其可作为芳香族氨基酸合成途径的碳骨架来源。糖酵解中间产物3-磷酸甘油酸可以作为甘氨酸(Glycine)和丝氨酸(Serine)生物合成途径的碳骨架来源。本研究中转录组结果显示, 上述途径相关酶的编码基因在C.sorokinianaGT-1异养转自养过程中均是持续下调。

光合作用藻类含有两个作用中心(P700和P680)和两个光系统(PSⅠ和PSⅡ)[32]。PSⅡ光解水和放氧, 并把释放的电子送入光合电子传递链,PSI通过合成NADPH给细胞生长与代谢提供还原力[32]。转录组分析显示光系统Ⅰ、光系统Ⅱ及光捕获复合体(Light-harvesting complex, LHC)相关基因在C. sorokinianaGT-1转入自养条件下均上调,自养48h后开始下调, 其中光系统Ⅰ亚基PsaO编码基因在转入自养条件下24h上调430%(P≤0.001),光系统Ⅱ蛋白PsbW和光系统Ⅰ亚基Ⅴ编码基因在转入自养条件下24h上调308%(P≤0.001), 光捕获复合体LHCA4、LHCA5和LHCB2的编码基因在转入自养条件下24h分别上调390%(P≤0.001)、337%(P≤0.001)和304%(P≤0.001), 其他光系统Ⅰ、光系统Ⅱ及光捕获复合体相关基因在转入自养条件下24h均上调了100%以上(P≤0.001), 说明C. sorokinianaGT-1转入自养条件下24h即适应光照。除此之外, 铁氧还原蛋白(Ferredoxin)的编码基因在转入自养条件下24h上调240%(P≤0.001), 并持续上调。

图 7 谷氨酸族和丙酮酸族氨基酸生物合成途径在异养转自养过程中转录水平的倍数变化Fig. 7 Fold-changes of the transcripts involved in the biosynthetic pathways of glutamate amino acids and pyruvate amino acids during the transition from heterotrophic to photoautotrophic culturing conditions

与此同时, 我们也观察到部分和光合作用相关的基因在转入异养条件后呈现下调的趋势。例如,细胞色素(Cytochrome)在转入自养条件下48h和72h分别下调485%(P≤0.001)和164%(P≤0.001)。质体蓝素(Plastocyanin)编码基因在转入自养条件下48h和72h分别下调190%(P≤0.001)和118%(P≤0.001)。F型运输ATPase(F-type H+-transporting ATPase)的编码基因在转入自养条件后持续下调。

3 讨论

本研究发现C. sorokinianaGT-1在异养转自养过程中细胞蛋白质含量显著提升, 并借助转录测序分析了此过程中C. sorokinianaGT-1基因表达的全局变化, 重点分析了碳、氮代谢相关的代谢途径在转录水平的动态变化, 试图为进一步优化培养条件和设计代谢工程策略提供理论基础。

3.1 C. sorokiniana GT-1异养转自养过程中心碳代谢途径在转录水平发生变化

对C. sorokinianaGT-1异养转自养过程中心碳代谢相关基因进行分析, 我们发现糖酵解途径上调,磷酸戊糖途径上调, 同时三羧酸循环途径下调(图 8)。这一现象与尖状栅藻(Scenedesmus acuminatus)异养转光自养的转录组分析结果一致[33]。糖酵解途径和磷酸戊糖途径均是产生还原能的途径[25,27]。我们推测, 在高密度异养条件下, 以小球藻和栅藻为代表的绿藻能将吸收的葡萄糖大量用于合成淀粉, 储存于细胞中; 当藻细胞转入自养条件后, 伴随着细胞结构的重塑, 藻细胞需要合成蛋白质和脂类分子, 因此需要大量还原能。目前也有研究表明当微藻细胞大量积累油脂时, 葡萄糖分解代谢会更加活跃[34]。例如, 莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)和单针藻(Monoraphidium dybowskii)在高光条件下积累油脂的过程中糖酵解途径关键酶的编码基因表达也呈现显著上调的趋势[35,36]。上述结果表明异养转自养条件后蛋白质含量提高的原因可能与细胞内还原能供应显著提高有关。因此, 提高细胞内葡萄糖分解代谢, 或阻断其进入淀粉合成途径, 可作为提高异养条件下蛋白质含量的策略之一。

3.2 C. sorokiniana GT-1异养转自养过程氮的吸收同化作用明显增强

对C. sorokinianaGT-1异养转自养过程氮代谢相关基因进行分析, 我们发现氮的吸收同化作用明显增强(图 8)。这一现象说明在自养条件下蛋白质含量提高的原因可能与自养细胞氮代谢(包括氮的吸收及同化)增强有关。值得注意的是, 本研究采用的是硝酸盐作为氮源, 而硝酸盐通过硝酸盐转运蛋白进入胞内, 首先需要在硝酸还原酶和亚硝酸还原酶作用下还原成铵根离子, 之后才能经过氨同化途径成为生物体可利用的有机氮, 这一过程需要大量还原能[30]。如前文所述,C. sorokinianaGT-1在异养培养条件下可能优先将吸收的葡萄糖用于淀粉合成, 产能途径并不活跃, 这也将间接影响硝酸盐的还原过程。基于上述分析, 我们认为如果采取铵盐作为氮源, 在氨转运蛋白的作用下直接进入细胞内进行同化, 该途径从能量角度将更加经济, 有可能克服异养条件下产能不足的瓶颈, 因此可作为提高异养条件下蛋白质的含量和产量的策略之一。目前也有研究证实了此猜想, Xu等[37]使用铵盐氯化铵和氨水作为异养发酵的氮源, 成功提高了小球藻蛋白质含量。

3.3 C. sorokiniana GT-1异养转自养过程氨基酸生物合成途径在转录水平发生变化

对C. sorokinianaGT-1异养转自养过程氨基酸生物合成途径进行分析, 发现不同类型的氨基酸生物合成的基因在异养转自养的过程中呈现不同的响应模式, 例如谷氨酸族氨基酸和丙酮酸族氨基酸生物生物合成途径上调, 而芳香族氨基酸、天冬氨酸族氨基酸和丝氨酸族氨基酸生物合成途径下调(图 7和图 8)。这说明营养方式不仅可以改变蛋白质的含量, 也会对蛋白质的氨基酸组成带来显著的影响。在本研究中, 丙酮酸族氨基酸的积累可能是C. sorokinianaGT-1在异养转自养过程中糖酵解途径上调丙酮酸积累的结果。在异养转自养过程中糖酵解途径增强生成了大量的丙酮酸, 丙酮酸既可作为其他物质(氨基酸和乙酰辅酶A)合成的前体,也可进入三羧酸循环[25,26]。丙酮酸流向了氨基酸合成途径, 这也间接反映了异养转自养过程氮同化途径的增强及三羧酸循环的减弱。

在异养转自养过程中增加的氨基酸可能在细胞适应变化的环境及不同营养模式的过程中扮演特殊的生理功能。精氨酸主要由鸟氨酸转化而来,是其他氨基酸代谢的前体, 也是细胞内有机氮的主要储存和运输形式[38]。另外有研究表明精氨酸的积累还可以维持逆境细胞内稳态, 帮助细胞快速从胁迫状态中恢复[39]。本研究中鸟氨酸合成途径在转入自养条件下48h后开始上调, 进一步反映了细胞内氮代谢增强, 有机氮以氨基酸形式储存在细胞内。细胞内的羟脯氨酸主要是与阿拉伯糖的糖苷键连接, 形成糖蛋白, 作为细胞壁的成分[40]。在自养条件下羟脯氨酸的积累说明了在不同培养条件下, 微藻的细胞壁结构可能发生改变。这一现象可以在未来的研究中进行探究。羟脯氨酸除了可作为细胞壁组成外, 还可以在脯氨酰基水解酶的作用下生成脯氨酸[41]。脯氨酸的积累通常发生在胁迫条件下, 脯氨酸可以维持细胞渗透压和稳定亚细胞结构, 消除自由基, 减轻细胞质酸中毒, 缓冲细胞内氧化还原电位及调节合适的NADP+/NADPH比例等[41—43]。并且有研究表明耐压植物的脯氨酸含量明显高于普通植物[44]。在本研究中脯氨酸合成途径相关酶的编码基因在异养转自养过程中均上调,这可能是细胞为了适应营养模式转变发生了内在调节, 同时脯氨酸的积累也作为C. sorokinianaGT-1在动态的环境中均能正常生长的前提条件。

图 8 小球藻异养细胞转入自养培养条件后与蛋白质含量增加有关的代谢途径变化模式图Fig. 8 Model on the changing metabolic pathways contributing to the enhanced protein contents of the Chlorella sorokiniana GT-1 cells during the transition from the photoautotrophic to heterotrophic conditions

3.4 C. sorokiniana GT-1异养转自养过程光合作用相关蛋白在转录水平发生变化

对C. sorokinianaGT-1异养转自养过程光合作用相关蛋白在转录水平的表达情况进行分析, 我们发现在异养条件下细胞内保留了部分的光合系统蛋白质, 在转入自养后这些蛋白的转录水平迅速上调。例如, 光捕获复合体叶绿素a/b蛋白, 结合微藻细胞内叶绿素, 具有捕获和传递光能, 维持类囊体膜结构等功能[45,46]。Lu等[47]研究表明葡萄糖的存在会降低绿球藻(Chlorococcumsp.)中光捕获复合体叶绿素a/b蛋白的mRNA丰度。并且Roth等[14]观察到去除培养基中葡萄糖后, 佐夫色绿藻细胞内类囊体膜会再生。因此, 在本研究中光捕获复合体叶绿素a/b蛋白在异养条件下表达量低的原因可能是由于缺少光激活及存在葡萄糖, 从而抑制了该蛋白的活性。除此之外, 本研究还检测到光系统Ⅰ和光系统Ⅱ相关蛋白的mRNA丰度在转入光自养培养条件后迅速上调, 说明光照激活了细胞内的光合系统。我们认为, 光合系统蛋白质的含量增加也为总蛋白含量的增加做出了显著的贡献。而值得注意的是, 部分光合蛋白在自养条件的转录本的绝对丰度比异养条件更低, 这些蛋白在异养条件下是否行使其他功能, 值得未来进一步探究。

综上所述, 本研究通过揭示C. sorokinianaGT-1在异养转自养条件下碳氮代谢基因表达的变化,分析了在自养条件下蛋白质含量提高的可能原因(包括糖酵解和磷酸戊糖途径增强, 为细胞提供了大量还原能和其他物质合成的碳骨架, 及在自养条件下细胞氮的吸收和同化效率高等), 为后续通过培养条件优化或代谢工程改造提高C. sorokinianaGT-1产蛋白质的能力提出了新的思路。