斑马鱼和鲤miR-1-2/133a-1基因间序列活性和调控研究

龚葭薇 何 梅 闫学春 孔德麟 梁 洋

(1. 东北林业大学, 哈尔滨 150040; 2. 中国水产科学研究院黑龙江水产研究所, 哈尔滨 150040)

鱼类广泛存在于自然界, 与人类生活息息相关。其中斑马鱼(Danio rerio)由于具有发育快、繁殖周期短、胚体透明、容易饲养及与人类基因组相似度高等特点已经作为模式生物被广泛应用于发育生物学、环境毒理学、医学和药理学等领域[1,2]。而鲤(Cyprinus carpioL.)是目前世界上养殖量最大的淡水鱼类之一, 其肉质具有高蛋白、低脂肪和人体必需氨基酸含量高等特点。既可以作为人类重要的食物来源, 也可以成为观赏动物[3], 同时, 近年来鲤也逐渐成为免疫学、生态学、环境保护学、发育生物学和生物进化等模式动物[4]。随着分子标记技术与遗传图谱绘制的发展, 鲤的一些特性, 包括耐寒、体重和血糖含量等性状已经开始被广泛研究[5], 但是迄今为止, 作为鱼类重要经济性状的骨骼肌形成分子生物学机制尚未被完全揭示。

microRNA(miRNA)是近年发现的一种高度保守的非编码小RNA(长度约22 nt), 在转录后水平调控基因表达。它们广泛参与器官发育、肿瘤发生、细胞增殖分化及细胞凋亡等生理过程[6]。在模式动物小鼠和斑马鱼中发现了多种与肌肉发育相关的miRNAs, 这些富含在心肌和骨骼肌组织中的miRNAs被称为myomiRs, 其通过对各自靶基因的作用而协同参与肌肉的发生、分化和再生等过程[7]。在对禾花鲤和建鲤肌间骨miRNAs的研究中也发现, miRNAs的表达水平控制成骨过程, 从而维持其肌间骨细小及柔软的特性[8]。我们前期通过分析鲤肌肉特异性miRNAs也发现, miR-1、miR-133、miR-206、miR-221、miR-222、miR-181和miR-208等在鲤肌肉发育中存在差异性表达, 其中miR-1和miR-133在小鼠(Mus musculus)、鸡(Gallus gallus)、爪蟾(Xenopus laevis)、斑马鱼和鲤等动物中高度保守[9]。在小鼠中, miR-1和miR-133以基因簇的形式存在, miR-1-1/133a-2位于2号染色体, 而miR-1-2/133a-1基因簇位于18号染色体[10,11]。Liu等[12]在小鼠中研究MEF2对miR-1-2和133a-1调控时发现, 在小鼠体内, 编码miR-1-2和miR-133a-1的基因之间存在一个330 bp的增强子片段, 受肌肉发育重要调控转录因子MEF2直接调控。而该区域约330 bp增强子结合位点包含一段保守的E-box(CANNTG), 可能是MyoD家族的结合位点。同时, 通过比较人、大鼠、狗和鸡等物种, 表明这一序列对于心脏和骨骼肌的表达是必要的, 且在脊椎动物中具有高度保守性。据此, 我们推测在斑马鱼和鲤中miR-1-2和133a-1基因间序列存在类似增强子的调控序列[12]。

综上, 本研究拟在前期工作基础上, 分析斑马鱼和鲤miR-1-2/133a-1的调控元件和转录因子, 克隆斑马鱼和鲤miR-1-2/133a-1的增强子序列, 探讨在鱼中miR-1-2/133a-1增强子序列调控机理; 并通过体外实验进一步分析MyoD对miR-1-2/133a-1的调控作用, 为完善哺乳动物肌肉发育机制研究, 及为鱼类分子育种奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验用载体

Hsp68-lacZ载体系国外友人Dr. Alan Peterson惠赠, 荧光素酶报告载体pGL3-Basic(Promega)、真核表达载体pcDNA3.1(+)(Invitrogen)和克隆载体pGEM-T Easy (Promega) 从公司购买。

1.2 实验动物与细胞

研究所用鲤鱼卵及成体组织均来自中国水产科学院黑龙江水产研究所呼兰实验站。实验用斑马鱼鱼卵及成体组织系黑龙江水产研究所自繁, 实验用细胞实验室自存。

1.3 实验方法

总RNA提取 取适量斑马鱼或鲤肌肉组织,液氮研磨, 加入Trizol裂解, 10000 r/min离心5min,取上清, 氯仿和异丙醇抽提, 然后以75%乙醇充分洗涤沉淀。适量无RNA酶的去离子水溶解沉淀, 检测总RNA浓度和纯度, 再利用PolyA聚合酶加尾, 利用接头引物(Ambion)反转录成cDNA, −20℃保存备用。

载体构建与鉴定(1)Hsp68-GFP报告载体的构建: 利用限制性内切酶NcoⅠ和HpaⅠ从pEGFP-N3质粒上切下GFP片段, 与同样双酶切的Hsp68-LacZ载体进行连接, 提取质粒, 酶切并测序鉴定正确后–20℃保存备用。(2)pGL3-Hsp68报告载体的构建: 利用KpnⅠ和NcoⅠ从上述Hsp68-GFP质粒上切下Hsp68片段, 定向插入同样双酶切的pGL3-Basic载体构建pGL3-Hsp68报告载体, 提取质粒, 酶切并测序鉴定正确后–20℃保存备用。(3)斑马鱼Hsp68-GFP和pGL3-Hsp68报告载体的构建: 通过NCBI查找斑马鱼miR-1-2/133a-1基因间序列(本文中缩写为dmi), 设计引物(表 1), 通过PCR以斑马鱼基因组DNA为模板克隆该片段, 测序正确后通过XhoⅠ和SmaⅠ双酶切分别将其定向插入Hsp68-GFP和pGL3-Hsp68报告载体, 提取质粒, 酶切并测序鉴定正确后−20℃保存备用。(4)鲤Hsp68-GFP和pGL3-Hsp68报告载体的构建: 通过NCBI查找鲤miR-1-2/133a-1基因间序列(本文中缩写为cmi), 设计引物(表 1)通过PCR以鲤基因组DNA为模板克隆该片段, 测序正确后通过ApaⅠ和SmaⅠ双酶切分别将其定向插入Hsp68-GFP和pGL3-Hsp68报告载体, 提取质粒, 酶切并测序鉴定后–20℃保存备用。(5)斑马鱼和鲤系列突变载体的构建: 通过限制性酶切(酶切位点见图 1A)及PCR(引物序列见表 1)构建不同长度的dmi缺失突变(示意图见图 1B), 并分别定向克隆入两种报告载体。(6)鲤MyoD基因克隆和真核表达质粒构建: 设计鲤MyoD全长基因引物(表 1), 以肌肉cDNA为模板进行扩增, 将产物与pGEM-T Easy载体连接和转化, 提取质粒, 经测序比对正确后将MyoD序列通过BamHⅠ和XhoⅠ双酶切转连至pcDNA3.1(+)载体,提取质粒, 酶切并测序鉴定正确后−20℃保存备用。

表 1 引物序列Tab. 1 Primer sequence

图 1 斑马鱼miR-1-2/133a-1基因间序列酶切位点(A)和系列缺失突变体(B)示意图Fig. 1 The schematic diagram of Danio rerio mir-1-2/133a-1 intergene sequence restriction site (A) and serial deletion mutant (B)

细胞复苏与传代培养NIH 3T3与C2C12细胞从液氮中取出后置于37℃水浴中快速融化, 转移细胞悬液至15 mL离心管, 加入5倍体积预热到37℃的合成培养基, 1000 r/min离心5min, 弃上清, 加入3 mL合成培养基, 温和吹打使其混匀, 转移到60 mm培养皿中, 置于CO2培养箱中进行培养, 每天观察细胞状态。培养条件: 37℃、5%CO2和95%空气。培养基配方: DMEM高糖培养基, 添加10%胎牛血清(ES-FBS, BI公司), 添加1%双抗和1% GlutaMAX(100×)。当复苏培养细胞汇合度达到80%左右时,按照常规方法, 将细胞进行1∶3传代培养。C2C12细胞的分化以2%马血清诱导。

细胞转染转染前一天将细胞接种于不含抗生素的培养基中, 细胞转染密度60%—70%时汇合, 按照Lipofectamine 2000(Invitrogen)说明书程序转染细胞。

双荧光素酶检测细胞转染48h后弃去旧培养基, PBS轻轻洗涤细胞2—3次; 加入通用裂解液,水平摇床室温摇15min使细胞充分裂解; 10000r/min离心3min, 取10 μL细胞裂解液于1.5 mL EP管,加50 μL萤火虫荧光素酶底物, 荧光光度仪测定萤火虫荧光素酶的活性值F, 再加50 μL海肾荧光素酶底物, 检海肾荧光素酶发光值R, 记录F值、R值和比值。

鱼卵显微操作显微操作采用日产IM-4A/B显微注射器, 玻璃针用日产自由落体式拉针器(PP-83)拉成孔径为6—8 μm的细尖。在Ø90 mm×18 mm平皿上, 铺一层厚2—3 mm的琼脂, 在其上挖一些与鱼受精卵大小相似的圆孔, 选取质量好的鱼受精卵固定在孔中, 平皿置在解剖镜下, 注射针以75度角进入受精卵。每个受精卵注射质粒体积为1 nL, 注射剂量为50—100 pg, 对照组注射生理盐水。注射后的鱼受精卵于28℃孵化。

2 结果

2.1 斑马鱼和鲤miR-1-2/133a-1基因间序列分析

通过NCBI分别获取dmi和cmi序列信息后, 根据设计的特异性引物(表 1), 以各自的基因组DNA为模板分别克隆获得2084和2242 bp目的片段,并进行序列比对。同时人、小鼠、斑马鱼和鲤保守区域的序列比对结果显示, 潜在的E-box元件(MyoD调控位点)在物种间高度保守。

2.2 斑马鱼和鲤基因间序列报告载体的构建

为了探究斑马鱼和鲤miR-1-2/133a-1基因间序列增强子的调控作用, 首先通过酶切和连接等方法分别获得Hsp68-GFP和pGL3-Hsp68基础报告载体,并将dmi(2084 bp)和cmi(2242 bp)全长序列分别定向克隆入上述两种报告载体。

随后, 按照图 1所示利用酶切及PCR获得不同长度的dmi系列缺失突变序列, 并定向克隆入上述两种报告载体中, 鉴定正确后进行斑马鱼增强子活性分析。

2.3 斑马鱼miR-1-2/133a-1基因间序列增强子活性分析

活体实验分析检测增强子活性将上述构建的dmi-Hsp68-GFP质粒注射斑马鱼胚胎, 72h后观察荧光, GFP呈现肌肉特异性表达(图 2A)。进一步将上述构建的dmi-Hsp68-GFP系列缺失质粒注射斑马鱼胚胎(按照从a到i的顺序注入胚胎, a为对照),72h后观察荧光, 缺失片段不同(图 2B), GFP表达量也不同, 保留有保守区域(1116—1432间序列, 缩写为cr)的载体(图 2C中b、f和g), 胚胎GFP表达量明显高于其他突变体(图 2C中c、d、e、h和i)。

离体实验分析增强子活性通过脂质体法将上述pGL3-dmi-Hsp68系列质粒转染小鼠C2C12细胞中, 并在分化前和分化后分别检测相对荧光素酶活性(图 3), 分化后的表达量均明显高于分化前,由于其缺失片段不同而导致荧光素酶活性明显不同, 保留有cr序列的b、f和g组, 在分化后荧光素酶活性显著高于分化前。

2.4 鲤miR-1-2/133a-1基因间序列增强子活性分析

活体实验分析基因间序列增强子活性无论活体实验还是离体实验, 上述结果都证明在斑马鱼中cr序列具有增强子活性, 因此推测在鲤中该区域有相似作用。将上述构建的全长cmi-Hsp68-GFP载体质粒注射鲤胚胎, 72h后观察荧光, GFP同样呈现肌肉特异性表达(图 4)。

离体实验分析基因间序列增强子活性通过脂质体法将pGL3-cmi-Hsp68质粒转染小鼠C2C12细胞中, 并在分化前和分化后分别检测相对荧光素酶活性(图 5), 分化后的表达量明显高于分化前, 且cmi的表达变化大于dmi。

2.5 MyoD调控miR-1-2/133a-1基因间序列分析

以在NIH-3T3细胞中转染pGL3-dmi-Hsp68(斑马鱼)、pGL3-cmi-Hsp68(鲤)和保守序列pGL3-cr-Hsp68质粒作为对照, 以分别将上述3种质粒与pcDNA-MyoD质粒共转染作为实验组, 结果显示,无论是斑马鱼还是鲤, 共转染pcDNA-MyoD组荧光素酶活性明显上调, 说明无论在斑马鱼还是鲤中,miR-1-2/133a-1基因间及保守区(cr)序列活性均受MyoD调控(图 6)。

3 讨论

鱼类肌肉发育与脊椎动物类似, 由多核肌纤维组成, 胚胎期经历了复杂的肌肉发生过程, 才发育为不同类型的肌肉[13]。成体骨骼肌有再生潜力, 依靠位于肌肉肌纤维膜和基底膜之间的骨骼肌卫星细胞, 在正常条件下卫星细胞处于静止状态, 在生理刺激下, 静止的卫星细胞才被激活, 然后增殖、迁移、分化, 融合形成新的多核肌纤维[14]。同时,激活的一部分卫星细胞返回静止状态, 通过自我更新补充干细胞库。目前大量证据表明非编码RNA,包括miRNA、长非编码RNA(lncRNA)和圆形RNA(环RNA), 也广泛参与卫星细胞激活、增殖、自我更新等重要的肌发生过程[15]。

图 2 dmi-Hsp68-GFP及突变质粒注射斑马鱼胚胎Fig. 2 Danio rerio embryo injected with dmi-Hsp68-GFP and mutated plasmid

图 3 pGL3-dmi-Hsp68系列质粒转染C2C12荧光素酶活性分析Fig. 3 Luciferase activity analysis of pGL3-dmi-Hsp68 series plasmids transfected with C2C12

图 4 cmi-Hsp68-GFP质粒注射鲤胚胎后荧光分析Fig. 4 Fluorescence analysis of cmi-Hsp68-GFP after injection into carp embryos

图 5 pGL3-cmi-Hsp68质粒转染C2C12荧光素酶活性分析Fig. 5 Luciferase activity analysis by transfection of C2C12 with pGL3-cmi-Hsp68 plasmid

图 6 MyoD调控miR-1-2/133a-1基因间序列活性分析Fig. 6 Activity analysis of the intergene sequence of miR-1-2/133a-1 regulated by MyoD

3.1 斑马鱼和鲤中miR-1-2和miR-133a-1之间存在增强子序列

在模式动物小鼠和斑马鱼中, 与肌肉发育相关的miRNA被称为myomiRs, 这些myomiRs通过对各自靶基因的作用而协同参与肌肉的发生、分化和再生等过程。我们前期通过分析鲤肌肉特异miRNAs发现, miR-1和miR-133在小鼠、鸡、爪蟾、斑马鱼和鲤等动物中高度保守[9]。

已经有研究显示, 在小鼠中编码miR-1-2和miR-133a-1的基因之间存在一个330 bp的增强子片段, 受肌肉发育重要调控转录因子MEF2直接调控,该增强子具有肌肉特异性[12]。通过比较人、大鼠、狗和鸡等物种, 表明这一序列对于心脏和骨骼肌的表达是必要的, 且在脊椎动物中具有高度保守性[12]。据此, 我们分析斑马鱼和鲤序列信息, 结果显示, 在斑马鱼和鲤miR-1-2和miR-133a-1基因间也存在一段保守序列, 且包含E-box元件。进一步分析其是否具有肌肉特异性的增强子活性, 我们选择了Hsp68为启动子。热休克蛋白Hsp68是一个基础启动子, 正常情况下的转基因胚胎中检测不到启动子活性, 在受到热激或者外源增强子诱导情况下被激活[16,17]。因此, 在本实验中, Hsp68作为报告载体的启动子, 正常情况下几乎检测不到启动子后面GFP的表达, 而在Hsp68启动子前加入dmi或cmi的miR-1-2和133a-1的基因间序列后, 则显示GFP表达升高(图 2和图 4), 因此证明miR-1-2/133a-1基因间序列确实具有增强子活性。

无论在斑马鱼还是鲤中, miR-1-2/133a-1基因间序列的增强子活性, 以及MyoD对该序列的调控作用尚未见到相关报道。

3.2 增强子活性与保守序列相关且具有肌肉特异性

进一步分析显示, 这种增强子活性强弱与保守区域cr有关, 在斑马鱼体内利用dmi-Hsp68-GFP系列质粒注射胚胎72h后, GFP呈现肌肉特异性表达。缺失片段不同, 表达量也不同, 保留有cr(含有E-box)序列的质粒注射胚胎后, GFP表达量明显高于其他突变体(图 2), 说明miR-1-2/133a-1基因内增强子中的E-box对于骨骼肌的表达是必要的。

另外, 体外细胞转染试验结果显示, 在小鼠C2C12细胞中, 分化后的表达量均明显高于分化前, 且其缺失片段不同其荧光素酶活性明显不同,保留有cr的序列在分化后荧光素酶活性显著高于分化前(图 4和图 5)。关于实验中观察到无论分化前后荧光素酶活性均有不同程度升高现象, 推测由于3′端的部分片段在肌肉分化前具有抑制子活性, 这种抑制作用在分化中解除, 因此表现为分化后所有荧光素酶活性升高。而具有保守cr序列的荧光素酶活性显著高于其他实验组, 进一步说明miR-1-2和133a-1基因间序列的增强子活性具有肌肉特异性。

3.3 斑马鱼和鲤中miR-1-2和133a-1增强子序列受到MyoD调控

根据已经有报道, 小鼠中miR-1-2和miR-133a-1基因之间330 bp增强子区域包含一段保守的E-box(CANNTG), 可能是MyoD家族的结合位点[12]。Rao等[18]发现, 在小鼠C2C12细胞和人类成肌细胞分化过程中, miR-1-2和miR-133a-1被明显诱导表达, 通过ChIP实验证明, MyoD能够结合在miR-1-1/133a-2和miR-1-2/133a-1上游颈环区域, 提示在小鼠中该区域受到MyoD的调控。Liu等[12]在小鼠中也发现MEF2能调控miR-1-2/133a-1上游肌肉特异的增强子, 该区域约330 bp增强子区域包含一段保守的E-box (CANNTG), 正是MyoD家族的结合位点。据此, 分析斑马鱼和鲤序列信息, 也发现在miR-1-2和miR-133a-1基因间保守序列之间存在类似的E-box元件。

将cmi-Hsp68-GFP质粒注射鲤胚胎, 72h后观察荧光, GFP呈现明显肌肉特异性表达, 主要表现在生肌节部位, 与MyoD的表达相似(图 4)。进一步通过荧光素酶实验证明, 无论是斑马鱼还是鲤, miR-1-2/133a-1基因间及保守区(cr)序列活性均受MyoD调控(图 6)。

综上, 本研究发现无论在斑马鱼或者鲤中,miR-1-2/133a-1基因间序列确实存在可能与MyoD结合的E-box元件(CANNTG), 通过体内外实验验证了该区域的增强子活性, 并通过荧光素酶报告系统验证了MyoD对该序列具有调控作用, 从而暗示在鱼类中, miR-1-2和miR-133-a-1可能也是MyoD的下游基因。该研究为探明MyoD与2种重要的myomiRs(miR-1和miR-133)之间的表达调控关系, 完善脊椎动物肌肉发育调控机理, 及为鲤分子育种等打下基础。