不同浓度锶与淫羊藿苷联合应用对MC3T3-E1细胞增殖及骨向分化的影响

朱 晔，温黎明，李 任，毕文娟，于津建，戚孟春

骨质疏松症是中老年人常见的疾病之一，表现为骨吸收过度、骨量减少等对骨相关疾病治疗产生负面影响的症状。许多药物被用于治疗骨质疏松，其中金属元素锶(strontium，Sr)显示出较好的效果。作为人体必需元素之一，可促进成骨细胞增殖、Ⅰ型胶原(Collagen I, Col-1)合成和矿化；也可以通过多种机制或通道抑制破骨细胞生成，达到抑制骨吸收的效果。淫羊藿苷(icariin，ICA)是一种调节骨代谢的有效中药提取成分，近年来也被尝试用于治疗骨质疏松。Sr和ICA均对骨质疏松症有良好的防治作用，并被尝试用于促进成骨细胞成骨的研究中，但二者联合应用是否具有更好的促进细胞增殖和成骨的效果，尚需进一步证实。

1 材料与方法

1.1 实验材料

锶标准液购自上海麦克林生物科技公司；淫羊藿苷(纯度95%)购自日本TCI公司；MC3T3-E1细胞购自上海生命科学院细胞库；BCA 蛋白定量检测试剂盒与鬼笔环肽染色剂购自上海碧云天生物科技公司; CCK-8 试剂盒购自日本同仁化学研究所; 碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)活性检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；茜素红S染液购自上海麦克林生物科技公司。

1.2 实验分组

根据本课题组之前研究，单独掺Sr浓度为80～800 mg/L、单独掺ICA浓度为0.21～21 mg/L，可表现良好的促进MC3T3-E1细胞增殖效应，故本实验选用Sr的浓度分别为80、27和800 mg/L，ICA浓度分别为7×10、7×10和7 mg/L，并进行联合应用，以探究促进MC3T3-E1细胞增殖和成骨作用的最佳浓度配比。根据药物浓度不同，分为以下10组：空白组，不加Sr和ICA；S1I1、S1I2、S1I3组，Sr的浓度均为80 mg/L，而ICA浓度分别为7×10、7×10和7 mg/L；S2I1、S2I2、S2I3组，Sr的浓度均为27 mg/L，而ICA浓度分别为7×10、7×10和7 mg/L；S3I1、S3I2、S3I3组，Sr的浓度均为800 mg/L，而 ICA浓度分别为7×10、7×10和7 mg/L。

1.3 方法

1.3.1

荧光显微镜观察 将MC3T3-E1细胞按1×10/孔浓度接种于96孔板内，每组3个复孔；按细胞分组加入不同浓度的药物，于第1、4、7天和11 d每孔加入200 μl的4%的多聚甲醛溶液固定1 h后使用PBS漂洗，再于每孔中加入200 μl的0.5%的Triton-X，静置20 min后漂洗，再于每孔加入500 μl鬼笔环肽染色剂，避光条件下静置1 h后，每孔加入500 μm的DAPI染色剂，避光条件下静置5 min，使用激光共聚焦显微镜进行观察，每孔随机选取1个视野进行图像采集，对细胞数目进行定量评价。

1.3.2

MC3T3-E1细胞增殖CCK-8法检测 将密度为1×10/孔浓度的MC3T3-E1细胞接种于96孔板内，每组3个复孔。各组加药并于第1、4、7天和11 d使用CCK-8试剂盒检测细胞的增殖能力。按照试剂盒说明书加入CCK-8试剂后，于37 ℃环境下避光孵育4 h；然后将每孔的待测液吸取100 μl，并转移至新孔板，使用酶标仪检测450 nm波长下吸光度值，进行统计学分析。

1.3.3

细胞碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)活性检测 MC3T3-E1细胞按1×10/孔浓度接种于96孔板内，每组3个复孔。待细胞贴壁后，更换培养基为含2%胎牛血清和成骨诱导液的DMEM完全培养基并加药，于培养第4和7天检测各组细胞ALP活性。各组样品细胞的ALP活性采用ALP测定试剂盒检测，使用酶标仪检测520 nm波长下的吸光度值，进行统计学分析。

1.3.4

茜素红S染色 在每个Sr浓度(S1、S2、S3)的3组细胞中(不同ICA浓度)，选取细胞增殖活性和ALP活性相对较高的S1I2、S2I2和S3I3组，与空白组一起，将细胞按1×10/孔浓度接种于6孔板内，每组3个复孔。待细胞贴壁后，更换培养基为含2%胎牛血清和成骨诱导液的完全培养基。细胞在37 ℃的CO培养箱中培养21 d后，使用配置好的茜素红S染液进行矿化结节染色，自然光下拍摄照片。

2 结果

2.1 MC3T3-E1细胞增殖的荧光显微镜观察

MC3T3-E1细胞的荧光显微镜观察见图1。细胞数量定量分析显示(表1)，在4、7和11 d时，S1I2组细胞数量最多，与其他各组相比，差异有统计学意义(

P

<0.01)，S3I1、S3I2和S3I3组次之，而空白组除第1天外，在第4、7、11天细胞数量均最少，与其他各组相比，差异有统计学意义(

P

<0.05)。

2.2 CCK8检测MC3T3-E1细胞增殖活性

CCK-8检测MC3T3-E1细胞的增殖活性结果见表2。 1、4、7和11 d时， S1I2组吸光度值最高，空白组吸光度值最低，且差异有统计学意义(

P

<0.05)。上述结果与细胞增殖的荧光显微镜观察结果基本一致。

2.3 MC3T3-E1细胞的ALP活性检测

MC3T3-E1细胞的ALP活性检测由表3所示。4和7 d时，S1I2组吸光度值最高，其次是S3I3组，且差异有统计学意义(

P

<0.05)，其余组再次之，空白组吸光度值最低，且差异有统计学意义(

P

<0.05)。

表1 荧光显微镜观察细胞增殖数量分析

表2 MC3T3-E1细胞增殖CCK8检测分析

表3 ALP活性分析

2.4 茜素红S染色

MC3T3-E1细胞的茜素红S染色由图2所示。各组均可见红染颗粒，S1I2组红染颗粒最多，且整体颜色更深，说明矿化颗粒形成较多，S3I3组次之，S2I2组再次之，空白组红染颗粒最少。

图1 MC3T3-E1细胞增殖的荧光显微镜观察 ×40

图2 茜素红S染色在自然光下观察A：空白组；B：S1I2组；C：S2I2组；D：S3I3组

3 讨论

目前，治疗骨质疏松症的药物主要通过增加骨形成、抑制骨吸收等改善骨质疏松。同时促进骨形成和抑制骨吸收的双重作用也是Sr和ICA抗骨质疏松的核心优势。在Sr促成骨研究中，Julien et al报道Sr2+释放浓度大致在0.87～8.76 ppm时可具有较好的促成骨活性，然而Meunier et al发现，25和150 mg/(kg·d)的雷奈酸锶不能促进去卵巢大鼠成骨。在ICA促进成骨的研究中，Feng et al报道，3.5 g/L浓度的ICA可诱导骨保护素敲除小鼠的颅骨表面骨形成；然而Zhang et al报道骨保护素敲除小鼠灌胃ICA(0.3 g/kg)8周后，导致小鼠骨生成减弱。虽然以上研究的给药方案的不同，因而不同研究所采用的剂量是不可比拟的，但仍可从中推测Sr与ICA可能在一定范围内才能够具有促进成骨的效果。

有研究表明锶盐联合ICA对MSCs分化的效果要好于单一用药的效果，其机制可能是锶盐和ICA均可通过激活 Wnt信号，并促进成骨因子Runx-2的表达，抑制成脂因子PPAR-γ2的表达，所以会产生协同作用，致使两者联合应用的效果更佳。提示在一定浓度范围配比下联合应用这2种药，可能在不增加药物副作用的前提下一定程度上增加促成骨作用的效果。

本研究通过检测两者联合应用对成骨细胞的增殖、ALP活性及茜素红S染色的影响，探究Sr与ICA联合应用时能够促进成骨的最佳浓度。成骨细胞是参与骨生成的重要功能性细胞，其细胞增殖状态好坏是影响骨生成的重要条件。荧光染色法可以直观的观察前成骨细胞数量及生长情况，实验中各组的细胞数量及在早期的细胞形态均要优于空白组，说明在实验组所采用的用药浓度下，Sr与ICA联合应用有利于MC3T3-E1细胞的增殖。CCK-8法检测结果也同样印证了S1I2组浓度下促MC3T3-E1细胞增殖效果最好，提示Sr与ICA在此浓度范围内联合应用可促进前成骨细胞的增殖的效果更佳。

ALP活性的高低可反映出成骨定向分化能力和细胞促矿化能力。本研究中各组细胞经不同浓度药物处理及骨向诱导后，ALP活性检测结果显示，S1I2组ALP活性最高，且具有统计学意义，说明Sr与ICA联合应用可有效提高MC3T3-E1细胞ALP活性。为了分析Sr与ICA对细胞骨向分化的影响，茜素红S染色结果显示S1I2组促成骨效果最好，沉积的钙化颗粒最多，说明两种药物在该浓度Sr(80 mg/L )和ICA(7×10mg/L)下促进前成骨细胞骨向分化的效果最佳，此浓度下联合用药可能有助于促进骨质疏松状态下的成骨细胞的骨向分化。

综上所述，Sr与ICA联合应用对前成骨细胞MC3T3-E1细胞的增殖和成骨均有统计学意义的促进作用；且Sr在80 mg/L和ICA在7×10mg/L浓度联合应用时对MC3T3-E1细胞的增殖和成骨的促进作用最佳。Sr和ICA是否通过相同信号通路或通过其他信号通路起到促成骨的效果，以及其相关机制在后期尚待进一步研究证实。