肝细胞内相关mRNA抑制HBV复制与表达的功能验证

黄 鹏，邱 华，范春娇，毛德文，李 旺，蒙荫杰，何锦轶

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)为嗜肝DNA病毒，全世界大约有2.57亿慢性HBV感染者。HBV持续感染不仅引起慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)，也会显著增加肝硬化、肝衰竭及肝癌的发生风险，抗病毒是HBV相关慢性肝病治疗与防控的关键。干扰素和核苷(酸)类似物目前被认为是两类抗HBV药物，但两者均不能彻底清除共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA，cccDNA)。前期临床与实验研究表明，白花香莲解毒颗粒在抗HBV方面具有较好的效果，但其抗HBV机制尚未完全明确。课题组根据前期mRNA芯片筛选结果及miRNA的靶基因预测结果，选择过氧化物酶体增殖物激活受体α(peroxisome proliferator activated receptorsα，PPARα)、核因子I/B(nuclear factor I/B，NFIB)和白细胞介素-8(interleukin-8，IL-8)代表白花香莲解毒颗粒抑制HBV的靶mRNA进行抗HBV的体外验证实验。该研究采用慢病毒基因转染技术，通过HepG2.2.15和HBV1.3P-HepG2细胞模型，验证PPARα、NFIB和IL-8 mRNA表达对HBV复制与表达的影响，为进一步明确白花香莲解毒颗粒抑制HBV复制与表达的机制及探寻HBV新的治疗靶点提供实验室依据。

1 材料与方法

1.1 材料

HepG2细胞、HepG2.2.15细胞、293A细胞(上海诺百生物科技有限公司)，DH5α感受态细胞(上海唯地生物技术有限公司)；0.05% Trypsin、lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司；DMEM购自美国HyClone公司；凝胶回收试剂盒购自美国Axygen公司；NheI/AscI内切酶购自加拿大Fermentas公司；胎牛血清、Opti-MEM 、MEM培养基购自美国Gibco公司；包装质粒Packaging Mix购自美国Biomics Biotech公司；SYBR Green PCR Master Mix 购自美国Promega公司；Mouse Anti-HBsAg (H2F4)抗体、Anti-Mouse IgG H&L (PE/Cy5.5) preadsorbed购自比利时Gentaur公司；HBsAg、HBeAg化学发光法检测试剂盒购自上海东寰生物科技有限公司，批号：20181103；PCR引物合成及测序委托上海诺百生物科技有限公司完成。酶联免疫检测仪购自美国Rayto公司；BSL-Ⅱ级生物安全柜购自山东博科生物产业有限公司；台式冷冻离心机购自力康生物医疗公司；荧光定量PCR仪购自南京科信仪器仪表制造有限公司；CO培养箱购自上海润度生物科技有限公司；荧光显微镜购自意大利Sinico公司。

1.2 方法

1.2.1

mRNA慢病毒表达载体的制备

1.2.1.1 各基因CDS序列的扩增 在NCBI网站查询NFIB(NM_005596)、PPARα(NM_005036)和IL-8(NM_000584)序列，根据In-fusion技术设计上述基因的引物，并扩增基因的CDS序列，引物序列如表1。用HepG2基因组作为模板，用表1引物将基因CDS序列扩增，然后将扩增的序列插入慢病毒表达载体pL6.3-CMV-GFPa1-IRES-MCS中，获得mRNA慢病毒质粒表达载体。扩增体系：10×PCR Buffer for KOD 5 μl、2 mmol/L dNTP 5 μl、25 mmol/L MgSO4 3 μl、引物F(10 mmol/L)1.5 μl、引物R(10 mmol/L)1.5 μl、模板1 ng、KOD 2.5 units，加水至50 μl；PCR扩增条件为：94 ℃、2 min，94 ℃、15 s，60 ℃、30 s，68 ℃、1 kb/min，30个循环，68 ℃、10 min。

表1 基因CDS序列扩增引物

1.2.1.2 慢病毒表达载体酶切及In-fusion连接 将pL6.3-CMV-GFPa1-IRES-MCS载体通过NheI/AscI双酶切，酶切体系：1×Buffer 5 μl、5 μg/50 μl质粒1 μg、NheI 2 μl、AscI 2 μl，加ddHO至50 μl。酶切产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳，切胶回收，得到线性化pL6.3-CMV-GFPa1-IRES-MCS载体。pL6.3-CMV-GFPa1-IRES-MCS线性化载体和HBV DNA-1.3P通过Infusion连接后转化DH5α感受态细胞，连接体系：5×CE II Buffer 4 μl、pL6.3-CMV-GFPa1-IRES-MCS线性化载体50～200 ng、HBV DNA-1.3P 20～200 ng、Exnase® II 2 μl，加ddHO至20 μl混匀。选择转化的克隆进行PCR鉴定，阳性克隆委托测序公司测序鉴定。

1.2.2

mRNA慢病毒包装及滴度测定 293A细胞经0.05% Trypsin消化并铺在10 cm培养皿中，细胞数为6×10个/皿，培养过夜。转染前，将培养皿内完全培养液换成5 ml Opti-MEM培养液。在5 ml EP管中加入1.5 ml Opti-MEM、9 μg Packaging Mix和3 μg慢病毒表达质粒，混匀；在另一5 ml EP管中加入1.5 ml Opti-MEM和36 μl lipofectamine 2000混匀。把质粒和lipofectamine 2000稀释液混匀20 min后，再将质粒脂质体复合物加入到培养皿中充分混匀，培养4～6 h后换培养液，培养48 h离心后收集上清液，过滤，获得慢病毒原液。使用荧光法测定病毒活性滴度。

1.2.3

HepG2和HepG2.2.15细胞MOI测定 293T细胞用胰酶消化后制成悬液，计算所需病毒液体积，每个感染复数 (multiplication of infection, MOI)梯度设加8%聚凝胺组和不加8%聚凝胺组，将所需的病毒液加至靶细胞中，对照为慢病毒侵染293A细胞，MOI值=1，加8%聚凝胺，放在培养箱中培养48 、72 h后，观察细胞存活状态和侵染后阳性细胞比例并拍照。

1.2.4

HepG2和HepG2.2.15慢病毒侵染及转染 病毒侵染前一天将靶细胞接种至96孔板(第2天细胞密度以60%～70%为宜)。将病毒液冰上融解后，根据测定的MOI值用含2%FBS的MEM培养基稀释，加8 μg/ml的Polybrene，混匀后将配置好的病毒液加入细胞中，培养箱中培养4～6 h后换液，观察细胞生长状态和荧光蛋白表达情况并拍照。把293A细胞接种于12孔板中培养，去除原来的培养液，换为opti-MEM，接着配置DNA或RNA与脂质体的复合物，将其加到细胞中孵育4～6 h后换液继续培养，24 h后观察转染情况。

1.2.5

qPCR检测HBV

DNA复制及结果分析 收集各组细胞，抽提总DNA。HBV DNA的检测引物(上游引物：CTCGTGGTGGACTTCTCTC，下游引物： CAGCAGGATGAAGAGGAA)；以18 S rDNA为内参，扩增引物为引物18S-F(序列：GAATTGACGGAAGGGCACCAC)和18S-R(序列：AAGAACGGCCATGCACCACCA)。基因倍数关系以R=2表示 。参考前期反应体系：2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μl、引物F 1 μl、引物R 1 μl、模板 1 μl、RNase-free HO 5 μl；PCR反应条件：95 ℃、30 s，60 ℃、30 s，72 ℃、30 s，重复40个循环。

1.2.6

化学发光法检测细胞上清液中HBsAg和HBeAg表达量 参照前期实验方法，收集细胞上清液，测定HBsAg和HBeAg表达量，检测方法根据HBsAg、HBeAg试剂盒说明书。

1.2.7

免疫荧光法检测细胞内HBsAg表达量 参照前期实验方法，将细胞爬片，0.25%TRITON X-100/PBS孵育5 min，使细胞通透，用10%BSA/PBS，37 ℃下孵育30 min，再用3%BSA/PBS稀释浓度为1 ∶100的Mouse Anti-HBsAg (H2F4)抗体，37 ℃下孵育2 h，3%BSA/PBS稀释浓度为1 ∶200的Anti-Mouse IgG H&L (PE/Cy5.5) preadsorbed，37 ℃下避光孵育45 min，荧光显微镜观察并拍照，将照片用Image-Pro Plus软件计算平均吸光度和分析荧光的强弱。

2 结果

2.1 mRNA慢病毒表达载体的制备

以HepG2基因组为模板扩增PPARα、NFIB和IL-8 mRNA的CDS序列，然后将该序列插入慢病毒表达载体pL6.3-CMV-GFPa1-IRES-MCS中，并对这些载体进行测序验证，获得构建正确的pL6.3-CMV-GFPa1-IRES-NFIB、pL6.3-CMV-GFPa1-IRES-PPARα和pL6.3-CMV-GFPa1-IRES-IL-8载体，见图1。

图1 pL6.3-CMV-GFPa1-IRES-NFIB、pL6.3-CMV-GFPa1-IRES-PPARα 和pL6.3-CMV-GFPa1-IRES-IL-8载体的测序图谱

图2 慢病毒滴度测定荧光图 ×100

2.2 mRNA表达慢病毒包装

将pL6.3-CMV-GFPa1-IRES-NFIB、pL6.3-CMV-GFPa1-IRES-PPARα和pL6.3-CMV-GFPa1-IRES-IL-8质粒分别和PSPAX2、PMD2G质粒共转染293A细胞后包装病毒，收集病毒液，浓缩。采用荧光法测定慢病毒滴度，实验分别用0.4 μl慢病毒液侵染1×10个细胞，pL6.3-CMV-GFPa1-IRES-NFIB感染细胞比例达到60%，其滴度为1×10×60%×10/0.4=1.5×10TU/ml；pL6.3-CMV-GFPa1-IRES-PPARα和pL6.3-CMV-GFPa1-IRES-IL-8病毒液感染细胞比例达到40%，其滴度为1×10TU/ml。见图2。

2.3 HepG2.2.15、HBV1.3P-HepG2细胞内各组mRNA相对表达量的比较

将PPARα、NFIB及IL-8基因分别转入HepG2.2.15、HBV1.3P-HepG2细胞中，将NC作为对照组，转染48 h收集细胞沉淀。秩和检验结果显示，在以上2种不同细胞中，NC组与PPARα组比较，差异有统计学意义(

P

<0.05)；NC组与NFIB组比较，差异有统计学意义(均

P

<0.05)；NC组与IL-8组比较，差异有统计学意义(均

P

<0.05)。见表2。

表2 HepG2.2.15、HBV1.3P-HepG2细胞内 各组mRNA相对表达量的秩和检验(n=6)

2.4 HepG2.2.15、HBV1.3P-HepG2细胞内各组HBV DNA相对表达量的比较

PPARα分别转染HepG2.2.15、HBV1.3P-HepG2细胞后能促进HBV DNA的复制，其表达程度分别是NC组的1.46倍和1.27倍，差异有统计学意义(

P

<0.05)；NFIB分别转染HepG2.2.15、HBV1.3P-HepG2细胞后可以抑制HBV DNA的复制，其表达程度分别是NC组的0.76倍和0.55倍，差异有统计学意义(

P

<0.05、

P

<0.001)；IL-8分别转染HepG2.2.15、HBV1.3P-HepG2细胞后可以促进HBV DNA的复制，其表达程度分别是NC组的1.54倍和1.62倍，差异有统计学意义(

P

<0.05、

P

<0.001)。见表3。

2.5 HepG2.2.15、HBV1.3P-HepG2细胞上清液中各组HBsAg、HBeAg表达量的比较

与NC组比较，在HepG2.2.15、HBV1.3P-HepG2细胞上清液中，NFIB转染后可以下调HBsAg和HBeAg表达，差异有统计学意义(

P

<0.001、

P

<0.05)；在HepG2.2.15、HBV1.3P-HepG2细胞上清液中，PPARα和IL-8转染后可以上调HBsAg和HBeAg表达，差异有统计学意义(均

P

<0.05)。见表4、5。

表3 HepG2.2.15、HBV1.3P-HepG2细胞内各组HBV DNA 相对表达量比较

表4 HepG2.2.15、HBV1.3P-HepG2细胞上清液中 各组HBsAg表达量比较

表5 HepG2.2.15、HBV1.3P-HepG2细胞上清液中 各组HBeAg表达量比较

2.6 免疫荧光检测mRNA在HepG2.2.15、HBV1.3P-HepG2细胞内对HBsAg表达的影响

与NC组比较，NFIB转染HepG2.2.15、HBV1.3P-HepG2细胞后HBsAg表达下降，差异有统计学意义(

P

<0.05)；PPARα和IL-8转染HepG2.2.15、HBV1.3P-HepG2细胞后HBsAg表达上调，差异有统计学意义(

P

<0.05)。见表6，图3、4。

3 讨论

HBV是用超螺旋结构cccDNA把其基因组物质储存起来，在细胞核内能够持久存在，而且宿主免疫应答不能干扰它。干扰素和核苷(酸)类似物这两大抗病毒药都不能干预到cccDNA，这成为HBV感染很难治愈的关键因素。宿主与病毒通过长时间的相互竞争，使得其抗病毒机理变得复杂。因此，在研究HBV与宿主之间关系的同时，尤其需要关注和有必要从宿主肝细胞内探寻药物治疗的新靶点。

表6 免疫荧光检测mRNA在HepG2.2.15、HBV1.3P-HepG2 细胞内对HBsAg表达的影响

图3 免疫荧光检测mRNA在 HepG2.2.15细胞内对HBsAg表达的影响 ×100

图4 免疫荧光检测mRNA在HBV1.3P-HepG2细胞内 对HBsAg表达的影响 ×100

mRNA是由DNA的一条链作为模板转录而来的，携带遗传信息且能指导蛋白质合成的一类单链核糖核酸。越来越多的研究表明，mRNA在HBV复制中扮演着重要的角色。过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferators-activated receptors，PPARs)根据功能不同，将其分为PPARα、PPARβ/δ和PPARγ3种亚型。研究表明PPARα反义序列PPARα-2能够使细胞中的PPARα mRNA和蛋白水平降低，随着剂量的增加，抑制肝癌细胞中HBsAg和HBeAg的水平越明显。Chen et al报道miR-141-3p能通过靶向PPARα mRNA，将HBV启动子的活性减少，从而抑制HBV复制。

NFIB属于核因子-I(nuclear factor-I，NF-I)家族，NFIB是其成员之一，参与各种细胞的基因转录和调控。HBV基因组中有3个NF-I结合位点可以被识别出来，且各自发挥着不同的功能。许多细胞与HBV基因启动子含有NF-1的结合点，表明HBV基因启动子的有效活化需要NF-1的参与，缺失部分或整个NF-1结合点导致HBVS基因的转录降低5～10倍。Guo et al发现NFIB对HBV增强子和核心启动子(ENⅠ-Cp)具有抑制作用，同时还能降低HBsAg和HBeAg的表达，miR372可以与NFIB相结合，从而阻止NFIB抑制HBV复制的作用。

IL-8是肝细胞内重要的炎症趋化因子，迄今为止尚不清楚IL-8在HBV致病过程中的作用。穆玄玄 等报道HBV相关慢加急性肝衰竭患者肝组织及外周血IL-8水平显著升高，且血清IL-8水平与患者肝脏炎症损伤和病情严重程度有关。近年来研究表明，在HBV感染早期阶段，IL-8可以促进HBV复制，IL-8过表达可导致肝细胞内产生许多HBV转录因子，可以促进CHB患者发生慢性化和重症化的风险。

本研究通过慢病毒将PPARα、NFIB及IL-8转入HepG2.2.15和HBV1.3P-HepG2细胞模型中，秩和检验结果显示，在以上2种不同细胞中，NC组与PPARα组、NFIB组、IL-8组两两比较，差异均有统计学意义，说明PPARα、NFIB及IL-8在上述细胞模型中能够正常表达。mRNA干预HBV功能验证显示，PPARα、IL-8能够增加HBV DNA表达量及上调HBsAg、HBeAg表达水平，而NFIB能够减少HBV DNA表达量及下调HBsAg、HBeAg表达水平。随后采用免疫荧光检测mRNA在2个细胞模型内对HBsAg表达的影响，结果显示，NFIB转染HBV1.3P-HepG2后HBsAg表达下降，PPARα和IL-8转染后HBsAg表达上调。本研究在细胞模型内外同时做了验证，因此得出结论，肝细胞内PPARα和IL-8是一种促进HBV复制的mRNA，而NFIB是一种抑制HBV复制的mRNA，这与吴小桃 等、Guo et al、穆玄玄 等的研究结果有相似之处。与上述研究不同的是，本实验在HepG2.2.15细胞中验证的同时，选择前期成功构建的HBV1.3P-HepG2模型进行验证，该模型不仅能够稳定表达HBV标志物，而且HBV1.3P能反映病毒株的自身复制情况，有利于研究HBV复制与转录调节的全过程。

综上所述，本实验利用慢病毒基因转染技术，观察到转染后的mRNA在HepG2.2.15和HBV1.3P-HepG2细胞模型中，其中PPARα、IL-8能够促进HBV复制，而NFIB可以抑制HBV复制，但它们通过何种途径促进或抑制HBV复制，其机制有待进一步深入研究。NFIB可能成为治疗HBV的新型药物作用靶点，有待在动物模型上进一步验证其抑制HBV的疗效。本研究显示，在HepG2.2.15、HBV1.3P-HepG2细胞模型中过表达IL-8能够提高HBV复制水平。该研究结果可能有助于更好地认识肝脏炎症与HBV DNA载量之间的辨证关系，明确中医药(包括壮医药)在抗HBV领域的定位与价值，实现中医药抗HBV治疗的新突破。