盘基网柄菌DJ-1蛋白的原核表达及抗体制备

侯碧巍,陈苏维

(安康学院现代农业与生物科技学院,中国陕西安康725000)

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是次于阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)的第二常见神经退行性疾病,其病理特征主要表现为脑部黑质区多巴胺能神经元变性和路易小体形成[1]。Bonifati等[2]于2003年在患帕金森病的意大利和荷兰家族发现了DJ-1基因突变型:14 000 bp缺失和L166P点突变。此后,一些独立研究表明,DJ-1不同突变型均与先天性或零散发病型帕金森病相关[3～5]。

许多学者对帕金森病相关基因DJ-1的功能进行了探讨。Hao等[6]发现,提高果蝇DJ-1表达水平可以降低由PINK1突变引起的功能损伤,而且这个作用取决于DJ-1的氨基酸残基C106。Thomas等[7]认为,Parkin可能作为DJ-1的下游基因保护多巴胺能神经细胞免受因DJ-1缺失引起的损伤。也有学者提出,PINK1、Parkin和DJ-1可能形成200 kD的复合物(PPD),此PPD复合物的不同结构域相互作用,促使未折叠或折叠错误的蛋白质通过泛素蛋白酶复合体降解[8～9]。还有研究认为,DJ-1可能通过分子伴侣清除细胞内异常累积的蛋白质发挥保护作用[10～11]。对于DJ-1的亚细胞位置,Bonifati等[2]发现DJ-1定位于细胞质和细胞核;Junn等[12]发现DJ-1定位于线粒体基质和线粒体内膜;陈苏维[13]则表明:DJ-1在正常情况下位于胞质内,当细胞受到氧化应激时,DJ-1蛋白完成从胞质到线粒体的转移。

DJ-1在人类帕金森病中的作用及其亚细胞位置争议很多。在高等实验动物模型中,基因型和表现型的相关性复杂,简单真核模式生物盘基网柄菌(Dictyostelium discoideum)则简化了基因型和表现型相关性的复杂性,能提供可读性强、准确性高的基因型和表现型相关性[14～16]。本研究将在大肠杆菌内对人类帕金森病相关DJ-1的盘基网柄菌同源蛋白质进行原核表达和纯化,制备其相应抗体,并在大肠杆菌和盘基网柄菌细胞内进行抗体检验,为后期测定盘基网柄菌细胞内DJ-1蛋白的表达水平和利用抗体标记确认DJ-1蛋白的亚细胞位置奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

实验所用菌株为E.coli M15和D.discoideum AX2,质粒载体为pQE-30,均由澳大利亚Fisher教授实验室提供,所用菌株基因型的相关信息见表1。

表1 实验菌株名称及基因型Table 1 The strain names and genotypes

T4 DNA连接酶、BamHⅠ和HindⅢ等限制性内切酶均购自美国Promega公司;Taq聚合酶、Alexa-FluorR-AP、anti-rabbit fluorescein、anti-His HRP 和 PureLinkTMHiPure Plasmid Maxiprep Kit均购自美国Invitrogen公司;HL-5培养基购自美国Formedium公司;蛋白酶抑制剂(25×,cocktail tablet)和Laemmli(1×)均购自美国 Roche公司;增强化学荧光(enhanced chemifluorescence,ECF)购自瑞典Amersham公司;其他常见试剂购自美国Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 引物的设计与合成

参照盘基网柄菌DJ-1基因序列,利用Pri-mer 6.0软件设计上、下游引物扩增DJ-1基因片段(DAM,去除终止密码子的DJ-1基因)。引物由墨尔本Geneworks公司合成,具体信息见表2。

表2 扩增盘基网柄菌DJ-1片段的引物序列Table 2 Primer sequences for amplification of DJ-1 fragment

1.2.2 DAM片段的PCR扩增、限制性酶切和连接

以盘基网柄菌总基因组DNA为模板,利用1.2.1设计的引物对盘基网柄菌DJ-1片段进行扩增,采用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物DAM。利用引物中已设计其序列位点的限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ对DAM及pQE-30质粒进行酶切,酶切后的DAM和pQE-30质粒在16℃进行过夜连接,形成连接产物pPROF696。

1.2.3 大肠杆菌转化株的获取、筛选及目的片段酶切鉴定

将100 μL电转感受态E.coli M15细胞与15 μL pPROF696混合,利用电穿孔法进行重组载体转化,采用蓝-白斑筛选法获取大肠杆菌E.coli M15转化株。利用碱裂解法提取重组原核表达载体pPROF696,并对其进行酶切鉴定。

1.2.4 盘基网柄菌DJ-1的生物信息学分析

利用ExPASy Compute pI/Mw tool(https://web.expasy.org/compute_pi/)估算盘基网柄菌DJ-1的相对分子质量;利用ExPASy ProtParam软件(https://web.expasy.org/protparam/)分析DJ-1的理化性质;利用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)和SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)软件分别预测DJ-1蛋白的二级结构和立体空间结构。

1.2.5 盘基网柄菌DJ-1蛋白的诱导表达及溶解性分析

将1.2.3获取的含pPROF696的大肠杆菌转化株置于含卡那霉素(25 μg/mL)和阿莫西林(100 μg/mL)的Luria Broth培养液中大量培养。加入1 mmol/L异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropylthio-β-D-galactoside,IPTG)诱导3 h,使DJ-1蛋白大量表达,然后4℃4 000 r/min离心10 min获得转化株。在200 mL转化株细胞液中加入含蛋白酶抑制剂(1×)的溶菌酶(1 mg/mL)进行裂解,再加入MgCl2(0.1 mol/L)和DNaseⅠ (0.1 mg/mL)降解DNA。4℃12 200 r/min离心10 min后,收集上清液和沉淀。在收集的20 μL上清液和沉淀(加入裂解缓冲液处理)中加入 5 μL SDS-PAGE 缓冲液(5×),95 ℃处理10 min使其变性,-20℃降温1 min,离心后再利用12%SDS聚丙烯酰胺凝胶对蛋白质进行分离(200 V,40 min)。考马斯亮蓝染色凝胶1.5 h后,利用Trans-Blot TurboTMblotting设备将分离的DJ-1蛋白转移至PVDF膜。双蒸水多次洗涤PVDF膜后,利用抗体(anti-His HRP,1∶1 000)对DJ-1蛋白进行免疫检测。

1.2.6 盘基网柄菌DJ-1蛋白的纯化

将500 μL Ni-NTA树脂悬浮液用12 200 r/min离心30 s,再用10 mmol/L咪唑缓冲液洗涤。将洗涤后的Ni-NTA树脂悬浮液加入1.2.5提取的含盘基网柄菌DJ-1粗蛋白的上清液,振荡处理使蛋白质-树脂结合30 min。将结合后的混合液加入含PD-10过滤器的过滤柱,利用20 mmol/L咪唑缓冲液洗涤过滤柱3次后,利用250 mmol/L咪唑洗涤液从过滤柱上洗脱盘基网柄菌DJ-1蛋白。

1.2.7 盘基网柄菌DJ-1蛋白抗体的制备和纯化

利用12%SDS聚丙烯酰胺凝胶对1.2.6纯化的盘基网柄菌DJ-1蛋白进行电泳,提取分离的DJ-1蛋白共345.6 μg,由IMVS(Institute of Medical and Veterinary Science)公司利用兔子分4个剂量共8周进行抗体制备。所得抗体用E.coli M15细胞中提取的盘基网柄菌DJ-1蛋白进行纯化。具体纯化过程如下:采用12%SDS聚丙烯酰胺凝胶对盘基网柄菌DJ-1蛋白进行电泳(200 V,40 min),转移至PVDF膜后用0.22%Ponceau S染色剂染色5 min,再利用5%醋酸脱色5 min,双蒸水洗涤两次,各5 min。将染成红色的蛋白质条带切下来,并用3%牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)4℃过夜培育。培育后的蛋白质条带用0.1%BSA 4℃洗涤6～8次,加入所得盘基网柄菌DJ-1蛋白抗体(1∶500),在4℃条件下进行过夜振荡培育。用0.1%BSA洗涤蛋白质条带3次,再用0.1%BSA和0.1%NP40混合液洗涤两次,随后利用150 μL 0.2 mol/L glycine-HCl(pH 2.5)洗脱所结合的抗体1 min,然后在抗体中加入含5%BSA的75 μL中和溶液(pH 9.0)进行中和。纯化后的抗体用磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline,PBS)(1×)于4℃条件下洗涤3次,加入0.1%NaN3防腐剂后置于-20℃贮存。

1.2.8 盘基网柄菌DJ-1蛋白抗体的检验

在E.coli M15中检验所制备的盘基网柄菌DJ-1抗体时,利用1.2.5的步骤进行细胞裂解并收集上清液,再将分离的DJ-1蛋白转移至PVDF膜。在盘基网柄菌菌株(野生株AX2和含DJ-1过表达载体的盘基网柄菌转化株)中,待细胞生长至密度为 1×106～2×106mL-1,收集大约 5×106个细胞,2 500 r/min离心 2 min,添加 15 μL 1× Laemmli缓冲液后在冰上裂解10 min;加入1 μL蛋白酶抑制剂(25×),将样品煮沸10 min后置于冰上迅速冷却;对15 μL粗制蛋白质样品进行12%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(200 V,40 min);利用Trans-Blot TurboTMblotting设备将DJ-1蛋白转移至PVDF膜。将上述从E.coli M15和盘基网柄菌菌株中获得的含DJ-1蛋白的PVDF膜在室温条件下用TBS冲洗两次,每次10 min,然后用5%脱脂牛奶室温振荡培育1 h。用TBST(TBS-Tween/Triton)缓冲液冲洗PVDF膜两次,随后用TBS冲洗1次,然后加入上述纯化的盘基网柄菌DJ-1抗体(用TBS溶解的5%脱脂牛奶稀释到1∶500),4℃过夜振荡培育。PVDF膜用TBST洗涤两次后用TBS洗涤1次,再加入第二抗体(anti-rabbit fluorescein,1∶5 000),黑暗中室温振荡培育1 h。按照上述方法洗涤PVDF膜,加入第三抗体(anti-fluorescein-AP Fab fragment,1∶2 500),室温培育1 h。洗涤PVDF膜,在膜上按24 μL/cm2加入ECF,室温放置5～10 min。用Whatman 3 MM过滤纸滤干PVDF膜,利用Storm 860TMFluoroimager进行扫描和记录。

2 结果

2.1 pPROF696重组载体的构建与酶切鉴定

利用BamHⅠ和HindⅢ限制性酶切位点将PCR扩增的DAM片段插入pQE-30质粒,经琼脂糖凝胶电泳鉴定和进一步纯化后,形成重组载体pPROF696。对pPROF696重组载体进行酶切鉴定,确认扩增目的片段的大小和连接方向正确(图1)。

图1 pPROF696重组载体的构建和酶切鉴定图中的DAM片段为除去终止密码子的DJ-1基因,全长615 bp。pPROF696重组载体含1个ATG起始密码子、6聚组胺酸标签(由pQE-30质粒提供)、DAM片段和1个终止密码子。酶切鉴定结果中,泳道1是1 kb DNA标记;泳道2是利用BamHⅠ和HindⅢ对pPROF696重组载体进行限制性酶切后的结果。Fig.1 Generation and restriction endonuclease digestion of pPROF696DAM in Fig.1 refers to the 615 bp full length DJ-1 without the stop codon.The pPROF696 construct contains an ATG start codon followed by a hexahistidine tag(provided by the vector),the DAM fragment and a stop codon.On the electrophoresis gel,lane 1 shows 1 kb DNA marker,and lane 2 shows the fragments of the construct pPROF696 digested with restriction enzymes BamHⅠand HindⅢ.

2.2 盘基网柄菌DJ-1的生物信息学分析

测序结果显示:盘基网柄菌DJ-1基因全长618 bp,不含内含子,共编码205个氨基酸。分析DJ-1蛋白肽链主平面结构发现,其包含80个α-螺旋、15个β-转角、68个无规卷曲和42个延伸链(图2)。理化性质分析显示:DJ-1蛋白的分子式为C1020H1616N268O311S8,相对分子质量为22.87 kD,总疏水性平均值为-0.124,表明盘基网柄菌DJ-1蛋白能溶于极性和非极性溶剂。此外,盘基网柄菌DJ-1蛋白的空间结构预测结果显示了其肽链主平面结构(图3A)及其活跃且保守的催化位点C117(图 3B)。

图2 盘基网柄菌DJ-1蛋白的氨基酸组成及肽平面结构h:α-螺旋;t:β-转角;c:无规卷曲;e:延伸链。Fig.2 The amino acid composition and peptide structure of D.discoideum DJ-1 proteinh:α-helix;t:β-turn;c:Random coil;e:Elongation strand.

图3 盘基网柄菌DJ-1蛋白的空间模型(A)盘基网柄菌DJ-1蛋白的空间结构。h、t、c和e分别表示α-螺旋、β-转角、无规卷曲和延伸链;(B)盘基网柄菌DJ-1蛋白的空间结构局域图。Fig.3 The tertiary structure of D.discoideum DJ-1 protein(A)The tertiary structure of D.discoideum DJ-1 protein.The letters h,t,c and e refer to α-helix,β-turn,random coil and elongation strand,respectively;(B)The local tertiary structure of D.discoideum DJ-1 protein.

2.3 盘基网柄菌DJ-1蛋白的原核表达及溶解性

大量培养含pPROF696的大肠杆菌转化株,并加入IPTG诱导DJ-1蛋白表达。对转化株细胞诱导产生的盘基网柄菌DJ-1蛋白进行裂解提取、上清液和沉淀收集、SDS-PAGE分析、考马斯亮蓝染色、Western-blot和抗体检测后发现:盘基网柄菌DJ-1蛋白主要出现在转化株细胞裂解液离心后的上清液中,沉淀中仅出现少量蛋白质(图4)。因此推测,盘基网柄菌DJ-1蛋白属于可溶性蛋白质,其相对分子质量介于19～26 kD之间,与利用ExPASy Compute pI/MW tool估算的理论相对分子质量(22.87 kD)一致(图 4)。

图4 盘基网柄菌DJ-1蛋白的原核表达1:提前染色的蛋白质标记物;2:来自转化株细胞裂解液离心沉淀的盘基网柄菌DJ-1蛋白;3:来自转化株细胞裂解液离心上清液的盘基网柄菌DJ-1蛋白。Fig.4 The expression of D.discoideum DJ-1 in E.coli1:Pre-stained protein marker;2:D.discoideum DJ-1 protein from the insoluble fraction of the transformant cell lysate;3:D.discoideum DJ-1 protein from the soluble fraction of the transformant cell lysate.

2.4 盘基网柄菌DJ-1蛋白的纯化

利用His标签的纯化树脂(QIAexpressionistTM)对盘基网柄菌DJ-1蛋白进行纯化。pQE-30质粒中含有插入的6聚组胺酸序列,通过Ni-NTA树脂中的6聚组胺酸抗体,与6聚组胺酸相连的DJ-1蛋白可以从树脂上进行洗脱和纯化。将纯化的DJ-1蛋白进行12%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western-blot后发现:DJ-1蛋白纯化效果较好,与预期大小相符(图5)。

图5 盘基网柄菌DJ-1蛋白的纯化1:提前染色的蛋白质标记物;2～4:纯化的DJ-1蛋白。Fig.5 Batch purification of D.discoideum DJ-11:Pre-stained protein marker;2～4:The purified D.discoideum DJ-1 protein.

2.5 盘基网柄菌DJ-1蛋白的抗体检验

为了检测从兔子血清中提取和制备的盘基网柄菌DJ-1蛋白多克隆抗体是否有效,先利用亲和纯化法对其纯化,然后分别在E.coli M15和盘基网柄菌菌株内进行检验。结果发现:所制备的抗体能够清晰地检测到含pPROF696的E.coli M15和含DJ-1过表达载体的盘基网柄菌菌株内的DJ-1蛋白,也能够检测到盘基网柄菌野生菌株(AX2)内的DJ-1蛋白,但条带较浅(图6)。

图6 盘基网柄菌DJ-1蛋白抗体检验1:蛋白质标记物;2:盘基网柄菌野生菌株AX2;3～4:无IPTG诱导和IPTG诱导的含pPROF696的E.coli M15;5～6:随机抽取的含DJ-1过表达载体的两株盘基网柄菌转化株。Fig.6 Verification of antibodies against D.discoideum DJ-11:Protein marker;2:The crude DJ-1 protein from D.discoideum AX2;3～4:Non-induced and IPTG-induced DJ-1 protein from E.coli M15 containing the construct pPROF696;5～6:The DJ-1 protein from two randomly chosen D.discoideum transformants containing DJ-1 overexpression construct.

3 讨论与结论

帕金森病主要由脑部黑质区的多巴胺能神经细胞受损或退化引起,研究表明氧化应激损伤、异常蛋白质累积和线粒体功能紊乱可能是导致帕金森病的重要机制[17～18]。目前,已发现有8个基因(蛋白质)与帕金森病相关[19],其中DJ-1基因位于位点PARK7,被发现在帕金森病的发生中起细胞保护作用,其缺失或突变能诱发帕金森病相关症状,主要功能包括调节基因表达、保证线粒体完整性、诱导蛋白质再折叠和降低神经元的氧化应激[20～21]。DJ-1对细胞的保护可能通过分子伴侣诱导的自噬作用清除细胞内异常累积的α突触核蛋白完成[22],而突变的DJ-1本身却被线粒体蛋白酶HtrA2清除[23]。但也有研究认为,在变性条件下DJ-1会像α突触核蛋白一样在细胞内异常累积,造成细胞损伤[24]。

本文的生物信息学分析和实验研究均证明盘基网柄菌DJ-1蛋白属于可溶性蛋白质(图4),而前期研究发现,盘基网柄菌DJ-1通过内吞作用完成对细胞的保护作用[25]。此外,本研究结果显示,与转化株相比,AX2菌株内的DJ-1表达水平相对较低(图6),提示抗体的灵敏度在AX2菌株检验时可能需要通过提高浓度达到(从1∶500提高到1∶300)。文中盘基网柄菌DJ-1蛋白抗体的成功制备,可用以验证绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)标记的盘基网柄菌转化株中DJ-1:GFP融合蛋白的表达,也可以测定DJ-1敲除、抑制和过表达后盘基网柄菌细胞内DJ-1蛋白的表达水平,并与相对应的表现型建立相关性,从而确立高等实验动物难以构建的基因型-表现型关系,探索DJ-1缺失或突变与线粒体功能缺失、异常蛋白质累积及帕金森病致病机理之间的联系和作用机理。

总的来讲,本研究利用除去终止密码子的盘基网柄菌DJ-1基因成功构建了其原核表达载体pPROF696,并利用E.coli M15菌株高效表达了盘基网柄菌DJ-1蛋白,进行了抗体制备;经检验,含pPROF696的E.coli M15转化株和盘基网柄菌转化株内的DJ-1表达水平都能够很好地利用所制备抗体进行检测和标定。