circ_102476在胃癌中的表达及临床意义

支 尹，万岱维，余 淼，张 喆，王 进，张 鹏，董晓强

（1.苏州大学附属第一医院普外科，江苏 苏州 215006；2.苏州市独墅湖医院，江苏 苏州 215125；3.淮安市肿瘤医院，江苏 淮安 223300）

胃癌是世界上第六大最常见的癌症，其死亡率排名全球第四。根据《2020年全球癌症统计报告》[1]，胃癌年发病人数为108.9万 人，占所有肿瘤发病人数的5.6%，死亡数为76.8万 人，占所有癌症病死人数的7.7%。根据国家卫生健康委员会发布的《胃癌诊疗规范（2018年版）》[2]数据显示，中国每年新增胃癌病例近50万 例，相当于每天确诊近1 400人。传统的胃癌诊治方案是手术，同时辅以放疗或化疗。但由于胃癌发病机制复杂，临床症状不典型，缺乏有效的早期诊断特征，胃癌患者被诊断时多为晚期，使得胃癌患者五年生存率差。因此，寻找可靠的早期胃癌诊断工具，对于胃癌患者的生存及预后颇为重要。

非编码RNA[3]不编码蛋白质，主要参与多种细胞活动，如基因沉默和激活、RNA剪接、修饰和编辑、蛋白质翻译等。环状RNA（circular RNA,circRNA）[4]是一种新型的非编码RNA，它具有封闭的环状结构，主要在真核细胞中表达。circRNA由线性前体信使RNA（mRNA）的非经典切割而成，显示出共价连续的闭环结构，没有3'帽子结构和5'多聚腺苷酸尾。circRNA主要来源于内含子与外显子，它能够抗核酸外切酶，具有稳定性高、进化保守性好、半衰期长等特点。

本研究通过基因表达综合数据库（gene expression omnibus, GEO）检索并分析获得胃癌组织中的circRNA表达矩阵，发现circ_102476在胃癌组织中明显下调，基于此进一步讨论circ_102476在胃癌中的表达及临床意义。

1 材料与方法

1.1 微阵列数据 从GEO中下载胃癌标本的circRNA数据集。获取的GSE89143数据集共包括3 例胃癌组织及3 例胃癌癌旁组织，并通过GPL19978 Agilent-069978 Arraystar Human CircRNA microarray V1平台进行分析，将探针矩阵转换为circRNA矩阵，共获得2 558 个circRNA。

1.2 数据分析 在R语言平台对circRNA数据进行标准化处理[5]。利用R语言中的“limma”包进行差异分析[6]，筛选条件为|log2FC|＞1，（BH法）P值＜0.05，得到GSE89143数据集的差异表达circRNA。R语言“ggplot2”包[7]用于绘制差异表达circRNA火山图；R语言“circlize”包[8]用于绘制聚类分析热图。获取差异表达最明显的前10位circRNA。

1.3 临床资料 纳入标准：术前未曾接受任何放化疗、靶向治疗等治疗，术后组织病理学诊断为腺癌。回顾性收集2014年3月—2019年3月在苏州大学附属第一医院胃肠外科就诊的92 例胃癌患者的胃癌及癌旁组织标本。获得的标本立即储存在液氮中。收集其他临床病理资料，包括年龄、性别、肿瘤直径、临床分期、是否发生远处转移、肿瘤分化程度等。

1.4 试剂和仪器 Trizol（Invitrogen公司）试剂用于提取RNA。上海生物生工有限公司合成circ_102476及内部参考GAPDH的引物。上海吉凯公司提供cDNA试剂盒、PCR试剂盒。使用2－ΔΔCt法分析和计算基因的相对表达。

1.5 实验方法 Trizol法提取总RNA，用紫外分光光度法测定RNA浓度和纯度，将1 μg总RNA反转录合成cDNA。以GAPDH为内部参照基因，提取反转录产物，在PCR仪器上进行扩增。反应条件：95 ℃预变性30 s，1 次PCR循环；95 ℃变性10 s，61 ℃退火30 s，40 次PCR循环。引物序列见表1。

表1 引物列表Tab.1 Sequence list

1.6 统计学方法 应用SPSS 26.0软件进行数据处理。计数资料以[例(%)]表示，卡方检验用于相关性分析，建立受试者工作特征曲线（ROC）。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 circRNA差异分析 数据集GSE89143中包含3 个胃癌组织及3 个癌旁组织共6 个样本，经处理共获得circRNA 2 558 例，据此绘制了胃癌组织及癌旁组织中circRNA表达的散点图（见图1）。对获得的circRNA进行差异分析，条件为|log2FC|＞2且P＜0.05，共筛选出99 例circRNA，其中上调1 例，下调98 例，根据筛选结果绘制了火山图及聚类分析热图（见图2、图3）。差异表达最明显的10 例circRNA见表2，其中hsa_circRNA_102476下调最显著。

表2 GSE89143中差异表达的circRNATab.2 Differentially expressed circRNAs list

图1 circRNA在胃癌组织及癌旁组织中的表达Fig.1 circRNA expression in gastric cancer tissues and adjacent tissues

图2 差异表达circRNA火山图Fig.2 Volcano plot of differentially expressed circRNAs

图3 circRNA聚类分析热图Fig.3 Heatmap of differentially expressed circRNA

2.2 circ_102476在胃癌组织中的表达 采用qRT-PCR方法对92 例胃癌患者的肿瘤标本和配对癌旁组织标本进行检测。检测数据显示胃癌组织中circ_102476的相对表达量较癌旁组织显著下调，差异具有统计学意义（P＜0.05，见图4）。

图4 circ_102476在胃癌组织及癌旁组织中的表达情况Fig.4 Expression of circ_102476 in gastric cancer tissues and adjacent tissues

2.3 circ_102476相关临床病理特征 依据circ_102476在胃癌组织及癌旁组织中的相对表达量，将患者分为下调组及上调组。相关临床病理特征分析（见表3）显示，circ_102476的表达水平与胃癌的临床分期（P＝0.037）、远处转移（P＝0.026）和分化程度（P＝0.030）相关，且当肿瘤较晚期、分化越差、产生远处转移时，circ_102476下调明显。

表3 circ_102476相关临床病理特征Tab.3 Relationship between circ_102476 expression and clinical features of 92 patients with gastric cancer

2.4 circ_102476在胃癌诊断中的临床价值 以circ_102476在胃癌组织和癌旁组织中的相对表达量作为检验变量，绘制ROC曲线（见图5）。分析结果显示，ROC曲线下面积为0.75，最佳截断值为24.95。

图5 circ_102476的ROC曲线Fig.5 ROC curve analysis for gastric cancer

3 讨论

胃癌作为全球最常见的恶性肿瘤之一，在亚洲地区的发病率较高。随着医学的发展，胃癌的病死率有所下降，但由于经常伴随淋巴转移、远处转移等，该疾病预后仍然较差。因此，发现有效的诊断工具，对胃癌的早期诊治极为重要。

自然界中，生物体中存在多种功能复杂的RNA，根据是否编码，它们一般被分为编码RNA和非编码RNA两大类。编码RNA通常指的是mRNA。非编码RNA是从基因组转录而成的RNA，不编码蛋白质，包括已知功能的RNA，如rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA和microRNA，也有未知功能的RNA[9]。非编码RNA根据碱基数可分成3类：长度大于500 nt的长非编码RNA；长度为50～500 nt，如rRNA，tRNA，snRNA，snoRNA，SLRNA，SRPRNA等；长度小于50 nt，包括microRNA，siRNA，piRNA。这些非编码RNA在转录和转录后水平发挥重要作用。

circRNA是一种特殊的非编码RNA。50 年前，当circRNA首次在病毒中被发现时，它被误认为是一种由外显子转录本错误剪接形成的低丰度RNA分子。随着基因测序技术和生物物理学技术的发展，对circRNA研究逐渐深入，circRNA已被证明具有半衰期长、高度稳定、进化保守等特点，相比于其他的非编码RNA不易被核酸内切酶水解[10]。因此，在疾病的诊断和治疗中，circRNA比其他非编码RNA具有一定的优势。

近年来，各种研究报道证实circRNA的许多成员广泛参与各种疾病进展。Stoll和Xu等[11-12]发现，circHiPK3在糖尿病中与mir-124-3p海绵结合，调节胰岛细胞的功能。Holdt等[13]报道，circaNriL能够调控血管细胞和组织的凋亡和增殖，起到预防动脉粥样硬化的作用。除了常见的慢性疾病外，circRNA在各种肿瘤中广泛表达，起着重要的调控作用。Zong等[14]报道称circ_102231在肺癌组织中显著表达，可以作为肺癌的分子生物标志物。Chen等[15]通过敲低circRNA_0000285抑制FUS的表达，从而抑制宫颈癌的形成和转移。Liu等[16]证实circ_001783作为miR-200c-3p的“海绵”与之结合，调控ZEB1/2和ETS1，推动了乳腺癌的进展。然而，目前有关胃癌中circRNA的表达与作用报道较少，相关的作用机制与通路仍有待探索。

GEO是一个公共功能基因数据存储库，提供检索工具帮助用户查询和下载实验和测序的基因表达谱。本文通过检索关键词“circRNA”、“gastric cancer”发现表达谱芯片GSE89143，获得3 对胃癌和癌旁共6 例样本。分析两组circRNA表达水平的差异，筛选出差异倍数在2倍以上的circRNA共99 例，其中，circRNA在胃癌中表达较癌旁上调1例，下调98 例，circ_102476下调最为显著（logFC＝－3.006，P＝0.012）。通过circBase及CSCD数据库检索发现，circ_102476来自于19号染色体，亲本基因为MYO9B，它是由MYO9B的10-12号外显子环化形成，长度为342 bp。

随后的研究中，我们依照一定的纳入标准，选取了92 例胃癌患者的组织标本。qRT-RCR检测显示，与癌旁组织相比，胃癌组织中circ_102476的表达显著下调（P＜0.05）。这一结果与挖掘数据库所获取的结论相一致。对结合记录所得患者的临床相关资料进行卡方检验，结果提示肿瘤较晚期（P＝0.037）、发生远处转移（P＝0.026）、分化程度较差（P＝0.030）是circ_102476表达下调的相关因素，预示着其既可以用于胃癌的诊断，也可能对胃癌患者肿瘤的进展进行预测。为了评估circ_102476诊断胃癌的效能，绘制了circ_102476表达的ROC曲线，结果显示，ROC曲线下面积AUC为0.75，提示circ_102476具有一定的诊断价值。

综上所述，本研究通过生物信息学方法获得胃癌组织样本中差异表达的circRNA，其中circ_102476下调最明显（logFC＝－3.006，P＜0.05），经qRT-PCR检测验证其在胃癌中表达下调，可能与胃癌的临床分期、分化程度、是否发生远处转移有关，表明该基因可能参与了疾病进展的过程。这一结果表明，circ_102476可作为胃癌早期诊断的工具。然而，circ_102476在胃癌中的作用机制和信号通路尚不清楚，仍需要未来进行进一步的研究。