大鼠髓核细胞退变模型的对比研究

杜 彤，谢依彤，王鹏博，戴顺捷，耿德春，毛海青

（1.苏州大学医学部，江苏 苏州 215123；2.苏州大学附属第一医院骨科，江苏 苏州 215006）

腰背痛（low back pain, LBP）是全球性的健康难题，约84%的成人在其一生中至少会发生一次LBP，且其中大约23%的患者症状会持续存在[1]。研究[2]证实，在美国，每年因LBP所引起的经济损失高达6 250亿 美元。在中国，LBP所致的伤残损失寿命年高达1 634.7万人年，是导致中国人群伤残负担的第一原因[3-4]。研究显示，椎间盘退变（intervertebral disc degeneration, IVDD）是诱发LBP的首要原因。然而，目前对于LBP的治疗局限于药物或者手术缓解症状，而针对IVDD并没有有效的治疗方法。椎间盘体外退变模型的建立是探究IVDD发生发展机制及找寻治疗方法的基础。因此，对比不同模型间的优缺点以找出合适的体外退变模型具有十分重要的临床意义。

椎间盘主要由三个部分组成：中央富于弹性的髓核、包绕于髓核外侧的纤维环以及位于上下的终板软骨[5]。一个健康的椎间盘能够吸收脊柱的轴向压缩应力，维持脊柱的稳定性[6]。在这一结构中，髓核细胞的退变是引起IVDD的主要原因。作为椎间盘内的主要组织，髓核主要由髓核细胞以及细胞外基质（extracellular matrix, ECM）构成。ECM作为髓核组织内的主要成分，主要由蛋白聚糖及Ⅱ型胶原（collagen Ⅱ, Col-2）组成，以维持髓核组织内的水分，维持正常的椎间盘高度从而吸收身体的轴向压缩应力[7]。研究[8]证实，退变的髓核组织会分泌大量的基质金属酶（matrix metalloproteinases,MMPs），影响ECM的代谢平衡，加速髓核组织内的水分丢失，影响椎间盘正常高度，改变椎间盘的正常力学环境，最终加速IVDD。但是，IVDD的具体机制还不是很明确。

目前，多项研究表明，IVDD是一个复杂的过程。影响IVDD的主要因素涉及氧化应激、炎症反应、衰老凋亡、异常机械负荷等[9]。H2O2作为三羧酸循环以及多种氧化酶代谢的产物，具有强氧化性，能够引起细胞内强烈的氧化应激，产生大量的活性氧（reactive oxygen species, ROS）[10]。过量ROS的堆积将引起髓核细胞DNA损伤，加速髓核细胞凋亡、衰老等多种病理过程，导致ECM代谢失衡，最终加剧IVDD[11]。此外，脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）作为革兰氏阴性菌的主要成分，当其与Toll样受体4结合时，通过衔接蛋白-髓样分化因子88激活丝氨酸/苏氨酸激酶，产生与白介素-1类似的炎症反应[12]。在退变的髓核组织中，多种炎症因子包括白介素-1β水平较正常椎间盘组织明显升高，产生局部炎症反应，加速ECM的分解代谢，最终加剧IVDD[13]。

在本研究中，我们拟通过使用H2O2以及LPS干预大鼠髓核细胞，探究这两种常用的体外诱导大鼠髓核细胞退变模型对髓核细胞ECM的影响。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：6 周龄雄性Sprague Dawley大鼠，购自苏州大学实验动物中心。

1.1.2 主要试剂与仪器：体视显微镜（Carl Zeiss公司）；逆转录仪（Bio-Rad公司）；Real-time PCR扩增仪（Bio-Rad公司）；酶标仪（Biotec公司）；蛋白电泳及转膜仪（Bio-Rad公司）；WB曝光仪（Bio-Rad公司）；胎牛血清、青链霉素（Gibco公司）；PBS（新赛美公司）；兔抗大鼠Col-2抗体、兔抗大鼠MMP13抗体（Abcam公司）；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔lgG（碧云天公司）；羊抗兔荧光二抗488、647（Abcam公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 髓核细胞培养基配置：髓核细胞增殖培养基：DMEM/F12（1:1）培养液、体积分数为10%胎牛血清、1%青链霉素。

1.2.2 髓核细胞培养：通过腹膜内注射过量戊巴比妥处死Sprague-Dawley大鼠。然后收集大鼠尾部的髓核组织，用0.5%的Ⅱ型胶原酶在37 ℃水浴中消化2 h。离心后，收集沉淀物，重悬并种植在6孔板中，与含有10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的DMEM/F-12培养基一起孵育。将6孔板置于恒温37 ℃且含有5% CO2的培养箱中。当细胞密度达到70%～80%时，将细胞用0.25%胰蛋白酶消化并重新种植在直径为10 cm的培养皿中。我们的实验使用了3代内的髓核细胞。

1.2.3 Western blot：使用补充有苯甲磺酰（Beyotime）的RIPA缓冲液获得6孔板培养的髓核细胞的总蛋白。通过BCA蛋白质测定试剂盒（Beyotime）定量蛋白质浓度。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）用于分离等量的蛋白质（20 μg），然后将其转移到聚偏二氟乙烯膜（Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，USA）上。随后，将条带用快速封闭液（Beyotime）封闭，并与适当的一抗反应：抗-β-actin（1:5 000，AF5001，Beyotime），抗-Col-2（1:5 000，ab34712，Abcam），抗-SOX9（1:5 000，ab185230，Abcam），抗-MMP9（1:1 000，ab283575，Abcam），抗-MMP13（1:5 000，ab39012，Abcam）。然后，加入二抗并孵育1 h。最后用电化学发光试剂（Thermo Fisher Scientific）检测。Image Lab 3.0软件（Bio-Rad Laboratories）用于量化条带图像。

1.2.4 PCR：我们使用TRIzol试剂（Invitrogen）提取总RNA，然后使用NanoDrop 2000（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）测量总RNA浓度。随后，我们使用PrimeScript RT Master Mix试剂盒（Takara，Kusatsu，Japan）进行逆转录，确保逆转录产物的浓度达到1 μg/20 μL，并使用逆转录产物进行扩增。每个反应共需20 μL液体，包括10 μL SYBR Premix Ex TaqTM、0.5 μL正向和反向引物、1 μL cDNA和8 μL无酶水。使用CFX96 Touch实时PCR检测系统（Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，USA）进行扩增。将循环阈值标准化为甘油醛3-磷酸脱氢酶（GAPDH）的水平。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.2.5 细胞免疫荧光染色：髓核细胞以10 000/mL的密度接种于24孔板中，并用不同的干预方法进行处理。12 h后，用PBS洗涤24孔板，随后依次用4%多聚甲醛固定细胞，用Triton透化，用快速封闭液封闭非特异性结合位点后，将细胞与一抗孵育，置于4 ℃冰箱过夜。第二天，将细胞与二抗置于37 ℃恒温箱中孵育1～2 h，最后用DAPI染色。

1.2.6 统计学分析：实验数据采用SPSS 25.0分析，两两比较在总体方差齐的条件下，选用LSD及Dunnett-t法进行分析。P＜0.05表示数据差异有统计学意义。

2 结果

2.1 髓核细胞培养 髓核细胞增殖传代后，倒置显微镜下观察髓核细胞贴壁生长，多数细胞呈梭形，生长状态良好，适用于后续实验（图1）。

图1 倒置显微镜下观察髓核细胞形态

2.2 H2O2、LPS诱导髓核细胞退变后ECM代谢指标比较 随后，我们进一步进行了Western blot及PCR实验，结果显示H2O2以及LPS能够明显诱导髓核细胞二型胶原（collagen Ⅱ, Col-2）、Y染色体性别决定区-盒转录因子9（SRY-box transcription factor 9, SOX9） mRNA及蛋白表达降低，同时促进其分解代谢指标基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinases 9, MMP9）、基质金属蛋白酶13（matrix metalloproteinases 13, MMP13）的升高。H2O2较LPS进一步促进了ECM分解代谢相关基因表达，而其对ECM合成代谢相关基因表达的影响则没有LPS明显（图2）。

图2 Col-2、SOX9、MMP9及MMP13的mRNA和蛋白表达水平

2.3 H2O2、LPS诱导髓核细胞退变后免疫荧光染色结果 通过免疫荧光染色，我们发现H2O2以及LPS能够明显抑制髓核细胞ECM中Col-2染色强度，同时均增强了MMP13的荧光强度。结果证实了H2O2和LPS均能够通过减少髓核细胞合成代谢、增强其分解代谢来诱导髓核细胞退变（图3，图4）。

图3 Col-2及SOX9的免疫荧光染色及其定量分析

图4 MMP9及MMP13的免疫荧光染色及其定量分析

3 讨论

IVDD是一种常见病，并且其发病越来越年轻化，给社会带来了巨大的经济及医疗压力，也给病人带来了巨大的心理和生理压力[14]。髓核细胞退变引起的ECM分解代谢增加、合成代谢抑制是引起IVDD的主要原因之一，然而目前尚缺乏针对性治疗[15]。氧化应激、炎症作为导致IVDD的重要原因之一，常用于体外诱导IVDD[16]。因此，在本研究中我们试图去比较LPS及H2O2对髓核细胞ECM代谢的影响以寻找合适的体外退变模型。

H2O2被证实能够参与包括髓核细胞炎症、凋亡、衰老、线粒体功能障碍以及抑制髓核细胞增殖的多种病理生理过程，最终促进包括MMP13、血小板反应蛋白解整合素金属肽酶5（A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 5,ADAMTs5）在内的ECM代谢相关酶类的表达，以促进Col-2及蛋白聚糖的降解，导致IVDD[17]。本实验中，我们发现H2O2确实能够促进MMP9、MMP13的上调以及Col-2、SOX9表达的降低，是一个合适的体外退变模型。而LPS能够引起包括炎症、焦亡、凋亡在内的多种病理过程，促进MMP13及ADAMTs4的表达，从而加剧IVDD[18]。而我们的结果显示，LPS也能够在促进MMP9、MMP13表达的同时抑制Col-2、SOX9的表达。

然而，本实验还存在一定的不足。我们选择比较的指标较少，没有比较其他MMPs及ECM成分（aggrecan等）的表达变化。并且没有比较其他因素（如细胞衰老，凋亡，线粒体功能紊乱等）以及其他干预措施（如叔丁基过氧化物，晚期糖基化产物等）对IVDD的影响。在接下来的实验中，我们会进一步比较不同干预措施对不同指标的作用。

在本研究中，我们通过免疫荧光染色、PCR以及蛋白印迹等多种手段证实H2O2及LPS均能够诱导髓核细胞ECM代谢变化，从而建立髓核细胞体外退变模型。LPS对ECM合成代谢相关基因表达的抑制作用更为明显，而H2O2更为明显地促进了ECM分解代谢相关基因的表达。