高海拔地区不同饮食习惯人群的肠道菌群差异研究

李亚楠，范雨佳，孙 欣，祁小飞，姚勇利，鲁 燕

（1.青海省人民医院内分泌科，青海 西宁 810007；2.苏州大学附属第一医院内分泌科，江苏 苏州 215006；3.苏州工业园区星湖医院内分泌科，江苏 苏州 215126；4.苏州大学附属第一医院，江苏省血液研究所，江苏 苏州 215006）

在人体胃肠道中大约有100万亿 个微生物，其数量比人类细胞的数量高出10倍[1]。肠道菌群被称为人体“隐藏的器官”，涉及多种生理功能，如：促进食物消化、营养物质的吸收、抵抗病原体、产生能量、免疫调节等，进而参与人体健康的维持[2]。肠道菌群受基因、分娩方式、年龄、性别、身体质量指数（body mass index, BMI）、生活环境、饮食习惯、生活方式、抗生素等多种因素的影响，其中基因和饮食因素起着重要的作用。肠道菌群在不同国家人群中存在差异，如欧美人群拟杆菌属含量最多[3]，韩国人群硒粪杆菌属含量最多[4]，蒙古人群普氏菌属含量最多[5]。我国不同民族人群肠道菌群亦存在差异，如黎族人群肠道中链型杆菌属、普氏菌属、巨型球菌属相对丰度高于其他民族人群[6]；维吾尔族人群肠道中乳酸杆菌属相对丰度高于汉族，而其他菌属均低于汉族人群[7]。目前欧美国家进行人群与肠道菌群的研究较多，我国较少，对于高海拔地区不同民族人群肠道菌群差异的研究更是鲜有报道。因此，本研究拟探索高海拔地区藏、汉两民族肠道菌群的差异并分析导致这种差异的影响因素，为中国人群肠道菌群的相关研究提供依据。

1 材料和方法

1.1 研究对象 选取青海省海南州共和县非疾病藏族人与汉族人各100 名作为研究对象。入选标准：(1)年龄18 岁以上；(2)本院体检结果正常，无急慢性疾病及传染病史；(3)BMI 18.5～22.9 kg/m2；(4)近1个月内无服用抗生素药物史；(5)无益生菌补充史。研究对象知晓研究目的及流程并签署知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 一般资料收集：非疾病藏族人与汉族人各100 名，2组性别、年龄差异无统计学意义（P＞0.05）。对藏、汉两组研究对象进行背景资料及日常饮食的种类及摄入量的问卷调查。

1.2.2 实验室检查：研究对象采集空腹血，检测空腹血糖（fasting plasma glucose, FPG）、丙氨酸转氨酶（alanine aminotransferase, ALT）、天门冬氨酸转氨酶（aspartate aminotransferase, AST）、γ-谷氨酰转肽酶（gamma glutamine transpeptidase, GGT）、甘油三酯（triglyceride, TG）、高密度脂蛋白胆固醇（high-density lipoprotein-cholesterol, HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoproteincholesterol, LDL-C）、血肌酐、血尿素氮（urea nitrogen, BUN）、血尿酸（uric acid, UA）。

1.2.3 粪菌采集：从研究对象中选取藏族与汉族人群各10 名，采集粪便样品，行16S rRNA基因高通量测序。具体操作如下：提前一天将粪便采集器交给研究对象，嘱次日晨起将粪便采集盒放在马桶上，两端固定，将卫生纸放在采集盒底部，2～3层，将大便解在卫生纸的上方，用采集勺在粪便中间内部取约花生粒大小（≥2 g）的粪便样品，将采集勺放入装有保存液的储存管中，摇匀，使粪便样品完全浸泡在保存液中，放置冰箱－80 ℃保存。汉族人群粪便样品标记为QHB1-10、藏族人群粪便样品标记为QHZ1-10。

1.2.4 DNA提取及16S rRNA基因片段PCR扩增：将DNA提取试剂盒提取的DNA作为模板，利用通用引物338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）扩增16S rRNA 基因的V3-V4可变区。

1.2.5 生物信息学分析和统计学方法：构建稀释性曲线；用R(3.4.1)语言对相似水平为97%的操作分类单元（operational taxonomic units, OUT）样品绘制韦恩图；用R(3.4.1)语言ggplot2对物种分类信息数据表绘制柱状图来表现不同分类水平上的群落结构；各物种所占比例用Krona软件显示；用kruskal_wilcox非参数检验分析Alpha多样性；主坐标分析（principal coordinate analysis, PCoA）采用非加权；物种的组间差异由Metastats、LEfSe软件进行分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

采用SPSS 25.0软件进行统计学分析。计量资料均先行正态性检验，符合正态分布的计量资料，以（±s）表示，两两比较采用LSD-t法；偏态资料以中位数M(P25,P75)表示，两两比较采用Wilcoxon秩检验（Wilcoxon's rank sum test）；采用Pearson相关行相关性分析；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 藏族与汉族人群一般资料比较 对藏、汉两组人群的性别构成、年龄、BMI、腰围（WC）、收缩压（SBP）、舒张压（DBP）、肾功、TG、HDL-C、LDL-C、ALT、AST、GGT、FBG、甲型肝炎抗体、丙型肝炎抗体及乙型肝炎抗原进行比较，两组人群差异均无统计学意义（P＞0.05）（表1）。

表1 藏族与汉族人群一般资料比较

2.2 藏族与汉族人群饮食结构比较 日常饮食种类及摄入量的问卷调查结果显示，藏族人群与汉族人群的饮食结构存在明显差异，藏族人群每日蛋白质、脂肪及酒精摄入量高于汉族人群，蔬菜、水果摄入量低于汉族人群，藏族人群以杂粮（小米、青稞等）为主食，汉族人群以细粮（大米、小麦面粉）为主食。（表2）

表2 藏族与汉族人群饮食结构差异

2.3 藏族与汉族人群肠道菌群组成比较

2.3.1 藏族与汉族人群粪便样本测序情况：从藏、汉两组研究对象中各随机抽取10 名进行粪菌检测，藏族人群10 个粪便样本，共获得350 288 条有效序列，进行质控过滤后获得301 752 条有效序列，聚类产生1 192 个OTU；汉族人群10 个粪便样本，共获得337 573 条有效序列，进行质控过滤后获得284 778 条有效序列，聚类产生1 623 个OTU。

2.3.2 藏族与汉族人群肠道菌群的稀释性曲线：通过作稀释性曲线，评估所采集样品的测序深度情况，图1示曲线逐渐平坦说明研究测序数据量合理，能够反映所采集样品的绝大部分肠道菌群信息。

图1 藏族与汉族人群肠道菌群的稀释性曲线

2.3.3 藏族与汉族人群肠道菌群OTU数目组成：藏汉两组人群共有的OTU为248 个，藏族人群独有的OTU为23 个，汉族人群独有的OTU为154 个。

2.3.4 藏族与汉族人群肠道菌群在门水平上的组成比较：在门水平上，藏族人群肠道菌群的优势物种依次为：拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门、梭菌门；汉族人群肠道菌群的优势物种依则次为：厚壁菌门、拟杆菌门、软壁菌门、变形菌门、放线菌门（图2）。

图2 藏族与汉族人群肠道菌群在门水平上的组成比较

Krona分析显示两组人群拟杆菌门/厚壁菌门（B/F）比例及普氏菌在拟杆菌中的比例存在差异（表3）。

表3 藏族与汉族人群肠道菌群中拟杆菌门与厚壁菌门的相对比例

藏、汉两人群肠道菌群共有且丰度大于1%的6个菌属为：拟杆菌属、粪杆菌属、粪球菌属、梭菌属、布芬特菌属、Butyricicoccus。

2.4 藏族与汉族人群肠道菌群的组间差异分析PCoA分析应用unweighted.unifrac方法比较两组人群样品间的差异，第1主成分的贡献率为61.44%，第2主成分的贡献率为16.04%，绿色为藏族人群，红色为汉族人群，图中显示藏族人群与汉族人群有明显的分离趋势，左上大部分为藏族人群，左下大部分为汉族人群，说明两组人群肠道菌群存在差异。两组人群可见聚类倾向，藏族人群在左上聚类明显，汉族人群在左下聚类明显，提示同组组间具有相似性。另外图中QHB 2也出现在左上方，考虑存在混杂现象（图3）。

图3 藏族与汉族人群肠道菌群PCoA分析

Matastats组间群落显著性差异分析结果显示，在门水平上藏族人群与汉族人群拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门、软壁菌门、放线菌门存在显著差异，藏族人群拟杆菌门、变形菌门相对丰度高于汉族人群，厚壁菌门、软壁菌门、放线菌门相对丰度低于汉族人群（图4）。

图4 藏族与汉族人群肠道菌群Matastats组间群落差异分析

LEfSe分析差异物种显示，绿色节点表示在藏族人群中起到重要作用的菌群，红色节点表示在汉族人群中起到重要作用的菌群，拟杆菌科、Alcaligenaceae科对藏族人群肠道菌群组成起重要作用，双歧杆菌科、Loriobacteriaceae科、乳酸杆菌科、Leuconostocaceae科、Christensenellaceae科、瘤胃球菌科则对汉族人群肠道菌群组成起重要作用（图5）。

图5 藏族与汉族人群肠道菌群的LEfSe分析

藏族人群拟杆菌中普氏菌、双歧杆菌及厚壁菌门中乳杆菌与汉族人群存在差异（图6），其相对丰度均低于汉族人群。

图6 藏族与汉族人群肠道菌群中普氏菌（A）、双歧杆菌（B）、乳杆菌（C）的差异*P＜0.05

2.5 饮食结构与菌群差异的相关性分析 肠道菌群中拟杆菌的丰度与蛋白质的摄入量呈正相关，普氏菌的丰度与细粮的摄入量呈正相关，软壁菌门的丰度与蔬菜、水果的摄入量呈正相关（表4）。

表4 饮食结构与菌群差异的相关性分析

3 讨论

现已有多项研究表明不同种族和民族的健康个体肠道菌群存在差异。一项来自欧洲和美国的6个临床中心对1型糖尿病（T1DM）基因高危婴儿的粪便菌群分析结果揭示了地理来源与不同肠道菌属的多样性和相对丰度之间的显著关联，尤其是双歧杆菌、Veillonella、粪杆菌、链球菌和阿克曼氏菌[8]。本研究的目的意在证实非疾病藏族与汉族人群肠道菌群存在差异，并探讨其差异的原因。

本研究选取的研究对象均来自青海省高海拔地区，平均海拔3 200 m的海南藏族自治州共和县，该地区农、牧资源丰富，藏族人群仍然保留了原始游牧民族的饮食习惯，两组人群生活的地理环境相同，避免了地理环境因素对于肠道菌群的干扰。两组人群一般情况无明显差异，肠道菌群16S rRNA基因高通量测序显示稀释性曲线平坦，说明数据合理，提示两组人群肠道菌群多样性无明显差异，均以拟杆菌门和厚壁菌门为核心菌群，但具体菌种的相对丰度存在差异。PCoA分析显示两组人群组内有聚类，组间分离明显，提示两组人群肠道菌群存在差异，但有混杂情况，需扩大样本量排除混杂因素。

生活方式、遗传、年龄、营养、药物和环境等因素均可导致肠道菌群发生变化，有研究表明生活方式（尤其是饮食结构）对肠道菌群的影响超出遗传和种族因素，如：成年双胞胎中，同卵双胞胎的肠道菌群并没有比异卵双胞胎的肠道菌群更相似，提示肠道菌群的遗传能力较弱，故本研究考虑饮食结构是导致藏、汉族人群肠道菌群差异的主要因素。

问卷调查结果显示藏族人群与汉族人群饮食结构存在显著差异。青稞、酥油、酸奶和茶为藏族人群的主要饮食组成，粗粮（青稞糌粑）占主食比例的大部分，牛、羊肉摄入较多，蔬菜、水果摄入较少，土豆为主要蔬菜，油脂摄入以动物油（酥油）为主，植物油比例较低，日常饮品以酥油茶和酸奶为主，饮食特点为高脂肪、高蛋白。汉族人群主食以面食（拉面、面片）为主，猪肉、蔬菜、水果及植物油摄入较多，牛、羊肉及动物油摄入较少。拟杆菌为蛋白水解菌[9]，可发酵肠道内蛋白水解菌降解蛋白质，故在高蛋白饮食为主的人群肠道菌群中拟杆菌数量增加[10]，高蛋白饮食在肠道内被菌群分解产生的代谢产物，可调控人体的肠道黏膜免疫，降低慢性炎症反应，改善代谢状态，这可能是藏族人群疾病发病率普遍低于汉族人群的原因。普氏菌有降解多糖、形成短链脂肪酸，分解碳水化合物和植物性蛋白质的作用，产生的乙酸可进入外周循环代谢合成胆固醇，故在复杂植物多糖为主食的人群肠道菌群中含量较高[11]，汉族人群长期进食大量碳水化合物，故肠道内易富集普氏菌。本研究调查显示藏族人群饮食以高蛋白为主（牛羊肉较多），缺少膳食纤维，汉族人群饮食以碳水化合物为主，我们推测这种饮食结构的差异，可能导致了肠道菌群的差异。

综上所述，本研究显示高海拔地区藏族和汉族人群肠道菌群存在明显差异，这种差异除了与遗传背景相关外，饮食结构不同对肠道菌群组成的影响也不容忽视。饮食结构不同导致肠道菌群的差异，但其具体的影响机制尚不明确，未来还需更深入的研究。通过调整饮食结构来影响肠道菌群结构为我们治疗相关疾病提供了新的思路。