居延海东西湖大鳍鼓鳔鳅线粒体COI基因测序分析

高 杰 ，缪丽梅 ，宗振东 ，罗旭光 ，王哲奇 ，红 海 *

（1.内蒙古自治区水产技术推广站，内蒙古 呼和浩特 010010；2.内蒙古农业大学，内蒙古 呼和浩特010010）

居延海位于内蒙古阿拉善盟额济纳旗，在巴丹吉林沙漠的北部边缘，曾是西北地区最大的湖泊之一。流入居延海的黑水河、金额济纳河发源于祁连山。清代后居延海分为东西两个湖泊，东居延海又叫苏泊淖尔，西居延海又叫嘎顺淖尔。1961年西居延海干涸，1992年东居延海干涸，大鳍鼓鳔鳅由此消失于此区域。2003年黑河改水工程后居延海又正式蓄水，使得大鳍鼓鳔鳅在居延海重新出现。

大鳍鼓鳔鳅 (Hedinichthysyarkandensis macroptera)是居延海特有的鳅科(Cobitidae)条鳅亚科(Nemacheilinae)鼓鳔鳅属(Hedinichthys)鱼类[1]。 目前，国内外学者对大鳍鼓鳔鳅的资源状况、生态特性、生物学特性、人工繁殖技术以及种群特征等方面进行了相应的研究[1-3]，但有关大鳍鼓鳔鳅的遗传多样性等方面的研究鲜有报道。遗传多样性可为遗传育种和物种进化提供遗传基础,遗传背景的调查分析对于物种的有效保护和合理利用至关重要[4]。线粒体DNA(Mitochondrial DNA，mtDNA)因其母性遗传、无重组等特性，是研究近缘物种遗传多样性的理想分子标记。线粒体COI(cytochrome oxidase subunit I)基因为位于线粒体DNA上的蛋白质编码基因，已广泛应用于物种鉴定和群体遗传学等方面的研究[5-8]。为了深入了解居延海大鳍鼓鳔鳅种质资源的遗传背景，此研究通过PCR扩增和测序，分析大鳍鼓鳔鳅mtDNA COI基因的遗传多样性，为该鱼在分子生物学的系统进化和多样性研究及合理开发和利用提供了初步科学依据。笔者及团队于2018年7月初对居延海东西湖大鳍鼓鳔鳅进行了系统采样工作，以期通过线粒体COI基因测序分析，对居延海东西湖两水域的大鳍鼓鳔鳅的基因关系进行分析。

1 材料和方法

1.1 材料

2018年7月3日采集于内蒙古阿拉善盟额济纳旗居延海的52尾大鳍鼓鳔鳅，其中东湖水域和西湖水域各采集26尾，标本采集后经形态学测量及称重后编号，活体解剖取其背部肌肉置于95%的乙醇溶液中，并在-20℃冰箱中保存备用。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA的提取和鉴定。将保存于95%乙醇中的标本组织取出，置于无菌蒸馏水中浸泡3 h以上，彻底除净乙醇；用组织匀浆仪将其打碎，取约100 μg匀浆后的组织，采用promega Wizard Genomic DNA Purification Kit试剂盒提取基因组DNA。提取的基因组DNA，用微量紫外分光光度计测量O.D.260/280比值以及DNA浓度。0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量和纯度。

1.2.2 引物设计。根据文献设计扩增COI区域的引物，序列如下：

L5956-COI:5'-CACAAAGACATTGGCACCCT-3'

H6558-COI:5'-CCTCCTGCAGGGTCAAAGAA-3'

1.2.3 PCR扩增和序列测定。基因扩增使用Takara Premix PrimeSTAR HS，反应总体积50 μL，包括：PCR Premix 25 μL，上下游引物各 2 μL，模板 1 μL，补充灭菌水至50 μL。PCR反应条件如下：95℃预变性5 min，然后重复25个循环包括95℃变性30 sec，58℃退火30 sec，72℃延伸80 sec，最后72℃延伸7 min。用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，凝胶成像仪下将扩增良好的条带进行切胶回收，用天根DP209-03柱式胶回收试剂盒纯化PCR产物。纯化后的PCR产物送至吉美公司进行测序。

1.2.4 数据处理。测定的DNA序列进行人工校正，采用DNAMAN(Version 5.2.2)软件进行个体和各鱼群间的序列比对，分析Cytochrome oxidase subunit I(COI)基因序列的核苷酸其碱基的组成、位点变异；用MEGA[10](Version 5.1)软件的 Maximum Likelihood方法进行系统进化树、遗传距离和GC含量等分析。利用DANsp v5[9]软件分析基因多态性及单倍型。

2 结果和分析

2.1 COI基因PCR扩增结果

本项目对52个标本的COI基因进行了序列测定，得到了全部标本的长度为645 bp左右的COI基因序列，扩增的凝胶电泳结果见图1。

图1 COI基因PCR扩增结果图

2.2 COI基因序列特征分析

2.2.1 GC含量分析。645 bp左右的COI基因PCR扩增产物的测序结果经过校对和拼接后，同源排序得到52个鱼标本的同源基因序列626 bp。用DNA MAN、MEGA软件分析同源序列，得到52个标本的同源基因片段GC碱基平均含量为41.70%，每个标本的GC含量详见表1。

表1 52个标本COI基因的GC含量

结果显示，52个标本COI基因的GC含量相当，无明显差异。

2.2.2 变异分析。52个标本的所有626 bp同源基因序中，突变总数7个，存在多态性位点/突变位点7个，单倍型数目为6，单倍型多样性（HD）为0.622，核苷酸的多样性（PI）为 0.00147。

2.3 鱼遗传多样性和遗传分化

2.3.1 系统进化分析。由图2可见，52个标本的COI系统进化树彼此之间的遗传距离相差不大，说明52个标本的COI基因彼此之间差异不大。从图3可以看出，52个标本的Cytb基因分布在两个大的分支上，不同的标本在系统进化树上分布较散，表明不同标本Cytb基因正在逐步进化。从系统进化分析显示，D37、D43单独形成1个分支，D37与D43之间的遗传距离较远，其余50个标本的Cytb基因单独形成另一个分支；除D37、D43之外的50个Cytb基因为主流进化分支 ， 该 分 支 向 着 D1、D3、D15、D18、D19、D20、D21、D29、D31、D35、D44、D48、D52 进化， 在此基础上进一步进化到 D4、D7、D13、D27、D30、D39、D45、D47 形成1个小分支（图3）。系统进化分析结果显示，COI基因的系统进化树分支与Cytb基因的进化分支有差异（详见图 3）。

图2 52个标本COI基因的系统进化图

图3 52个标本的Cytb基因系统进化树

2.3.2 遗传距离计算分析。遗传距离计算结果显示，52个标本的COI基因遗传距离彼此之间相差不大，平均遗传距离都低于0.006，说明52个标本的COI基因彼此之间亲缘关系较近，遗传距离与系统进化树的结果一致。

D37与D43之间的平均遗传距离为0.074，D37与其他 （除D43外的50个）标本的平均遗传距离为0.037，D43与其他（除D37外的50个）标本的平均遗传距离为0.077。D43的Cytb基因与其他标本的平均遗传距离大于D37与其他标本的遗传距离，表明D43的Cytb基因与其他50个标本的亲缘关系比D37与其他50个标本的亲缘关系远；说明D43的Cytb基因向着与其他标本的Cytb基因不同的进化方向进化，这与Cytb基因的系统进化图是一致的。

3 结论

综合居延海东湖26个样本和西湖26个样本，总计52个个体的COI基因特征、遗传多样性和遗传分化分析显示，52个标本的COI基因彼此遗传距离较近，说明居延海东西湖大鳍鼓鳔鳅标本的亲缘关系较近。基于Cytb基因的大鳍鼓鳔鳅单倍型多样性指数和核苷酸多样性分别为 0.716和0.0027，有较高的遗传多样性。推测大鳍鼓鳔鳅鱼种群在经历过瓶颈效应后，可能伴随产生了迅速的种群扩张与变异的积累，即提高了单倍型多样性，但没有明显增加核苷酸多态性。

本研究中大鳍鼓鳔鳅Cytb基因序列表现出较高的单倍型多样性和低水平的核苷酸多态性及遗传多样性，而这些鱼类近年来都面临着生存受到威胁的局面，这也从侧面说明，大鳍鼓鳔鳅这一特有的鱼类品种需要持续加强保护、恢复和开发。

基于Kimura双参数模型Cytb基因单倍型之间的遗传距离在0.001～0.010，整体来看，单倍型之间的遗传距离较小，说明大鳍鼓鳔鳅个体之间的基因交流不受限制。这是因为大鳍鼓鳔鳅运动能力较强，个体间基因交流不存在地理隔离限制。

52个标本的Cytb基因特征、遗传多样性和遗传分化分析结果显示，D43标本的Cytb基因进化方向与其余50个标本的Cytb基因进化方向不同，与其他标本的遗传距离最远，说明与其他标本的亲缘关系更远，单独形成1个进化分支。优势单倍型的个体适应能力强，拥有更大的繁殖群体，而低频率的单倍型则因其环境适应能力差，拥有的繁殖群体较小，更容易对整个种群的遗传多样性造成不利影响。因此,需要持续加强对其种质资源的评估，加大保护力度，合理开发利用,以保持尽可能多的遗传多样性，改善种群遗传结构，从而增加大鳍鼓醥鳅资源恢复及遗传复壮的机会。