正交试验与响应面法优选六月雪-草药对提取工艺比较*

2021-05-29胡风华金庆江骆建平

中国药业 2021年10期

范玲，王鑫△，胡风华，金庆江，尹浩，骆建平，薛毅

（1.江苏省苏州市中西医结合医院，江苏苏州 215101； 2.南京中医药大学翰林学院，江苏南京 225300）

糖尿病肾病是导致慢性肾脏病的第二位原因［1］，糖代谢紊乱是其主导因素［2］。中医认为，脾肾受损、气阴两伤、亏虚不足、脉络瘀阻是糖尿病肾病的主要病因病机，常以补肾健脾、益气养阴、活血化瘀通络的药物进行调理。六月雪-草是苏州市中西医结合医院金庆江主任中医师治疗糖尿病肾病的经典药对，六月雪始载于《本草拾遗》，来源于茜草科植物小灌木白马骨Serissa serissoides（DC.）Druce的全草或根，性凉，味苦、微辛，归肺、脾、肝、胃经［3］。六月雪含挥发油类［4］、醌类［5］、木脂素类［6］、萜类［7］、黄酮类［8］等化学成分，具有抗病毒、抑菌等药理作用。草始载于《新修本草》，来源于桑科草属草Humulus scandens.（Lour.）Merr.的全草，性寒，味甘、苦，归肺、肾经［9］。草含黄酮类、甾体类［10］等多种化学成分，有治疗急慢性肾炎、抗菌、抗炎等药理作用。现代药理学研究结果显示，六月雪能改善机体对抗原的清除作用，对受损的肾小球基底膜有一定修复作用，而草有治疗肾炎的作用，二者相须，联用效果更甚。本研究中探讨了六月雪-草药对的提取工艺，旨在为该药对的物质基础研究提供依据。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

1260型高效液相色谱仪，包括二极管阵列检测器、Chemstation色谱工作站（美国Agilent公司）；FA2004型电子天平（上海越平科学仪器有限公司）；GM-0.33A型隔膜真空泵（天津市津腾实验设备有限公司）；B-260型恒温水浴锅（上海亚荣生化仪器厂）；KQ5200型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；DW-2型调温电热套（通州市张芝山镇决心化工电器厂）。

1.2 试药

木犀草苷对照品（西安菲德生物科技有限公司，批号为19070302，含量为99.40%）；乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯，试验用水为娃哈哈纯净水；六月雪、草药材均购于苏州天灵中药饮片有限公司，经苏州市中西医结合医院于栋伟主任中药师鉴定为正品。

图1 高效液相色谱图Fig.1 HPLC chromatograms

2 方法与结果

2.1 木犀草苷含量测定

2.1.1 色谱条件

色谱柱：Poroshell 120 EC-C18柱（150 mm×2.1 mm，4μm）；流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液（17∶83，V／V）；流速：1.0 mL／min；检测波长：350 nm；柱温：25℃；进样量：10μL。

2.1.2 溶液制备

取木犀草苷对照品3.0 mg，精密称定，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，摇匀，即得对照品溶液。分别称取六月雪10 g、草5 g，回流提取，滤过，合并滤液，浓缩后作提取液。精密量取样品溶液10 mL，置蒸发皿中，水浴蒸干，残渣用甲醇溶解并定容至10 mL，经0.45μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。称取六月雪药材10 g，按供试品溶液制备方法制得阴性对照品溶液。

2.1.3 方法学考察

系统适用性试验：精密吸取2.1.2项下3种溶液各适量，按2.1.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应位置处有吸收峰，阴性对照无干扰。理论板数按木犀草苷峰计应不低于3 000，分离度均大于1.5，基线分离良好。见图1。

线性关系考察：精密量取2.1.2项下木犀草苷对照品溶液适量，加流动相制成质量浓度分别为6，12，15，24，30μg／mL的系列对照品溶液，置容量瓶中。按2.1.1项下色谱条件进样测定。以待测成分质量浓度为横坐标（X）、峰面积值为纵坐标（Y）进行线性回归，得回归方程Y＝22.34X＋17.65，r＝0.999（n＝5）。结果表明，木犀草苷质量浓度在6～30μg／mL范围内与峰面积线性关系良好。

检测限和定量限确定：取2.1.2项下木犀草苷对照品溶液适量，加甲醇逐级稀释，按2.1.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以信噪比（S／N）为3∶1的质量浓度为检测限，S／N为10∶1时的质量浓度为定量限。结果检测限和定量限分别为0.603 2μg／mL和2.084 9μg／mL。

精密度试验：精密量取已知含量（15μg／mL）的对照品溶液10μL，按2.1.1项下色谱条件进样测定。于1 d内连续进样6次，测定峰面积，结果的RSD为0.36%（n＝6），表明该方法日内精密度良好。于1 d内连续进样2次，连续3 d，测定峰面积，结果的RSD为0.98%（n＝6），表明该方法日间精密度良好。

稳定性试验：取同一供试品溶液，室温下分别放置0，2，4，8，12，24 h时按2.1.1项下色谱条件测定。结果的RSD为1.87%（n＝6），表明室温下供试品溶液在24 h内基本稳定。

重复性试验：取同一供试品溶液6份，依法制备供试品溶液，按2.1.1项下色谱条件进样测定。结果的RSD为0.52%（n＝6），表明该方法重复性良好。

加样回收试验：精密量取已知质量浓度的供试品溶液（木犀草苷质量浓度为11.57μg／mL）6份，每份10 mL，置蒸发皿中，水浴蒸干，残渣用甲醇溶解并定容，分别精密量取10 mL，各加入0.12 mg木犀草苷对照品。经0.45μm微孔滤膜滤过。按2.1.1项下色谱条件进样测定。结果见表1。

2.2 正交试验

2.2.1 试验设计

根据预试验结果，以加水倍数（A）、提取时间（B）及提取次数（C）为考察因素，以木犀草苷提取综合评分为考察指标，采用L9（34）正交试验优选木犀草苷的提取工艺。因素与水平见表2。药对中六月雪草比例为2∶1，即六月雪10 g、草5 g。试验过程中煎煮时使用电热套加热圆底烧瓶内回流提取，整个过程水分不流失。最后以木犀草苷转移率及水煎液浸膏得率的综合评分进行分析，综合评分＝木犀草苷转移率／木犀草苷转移率的最大值×70＋浸膏得率／浸膏得率的最大值×30。其中木犀草苷转移率（%）＝提取液中木犀草苷含量×100%／按药典测定的饮片中木犀草苷含量；浸膏得率（%）＝L×（m2-m1）／5×1／m×100%。L为煎煮后提取液总体积（mL），m2为含提取液的蒸发皿的质量（g），m1为蒸发皿净质量（g），m为煎煮饮片总质量（g）。正交试验设计与结果见表3，方差分析结果见表4。

表1 加样回收试验结果（n＝6）Tab.1 Results of the recovery test（n＝6）

由表3可见，各因素对试验检测指标的影响强度高低顺序为C＞B＞A；由表4可见，因素C对检测结果有显著影响。提取次数是影响综合评分的关键因素。分析得到的六月雪-草药对的最优提取工艺条件为A2B3C3，即加15倍水，提取3次，每次提取1.5 h。

表2 正交试验因素水平表Tab.2 The factors and levels of the orthogonal test

表3 L 9（34）正交试验设计与结果Tab.3 Design and results of the L 9（34）orthogonal test

表4 正交试验方差分析结果Tab.4 ANOVA results of the orthogonal test

2.2.2 验证试验

以最优提取工艺进行验证试验，所得综合评分的平均值为91.36分，RSD为0.97%，数据稳定，表明此提取工艺稳定可靠。

2.3 响应面试验

2.3.1 试验设计、结果与分析

依照Box Behnken响应面法的设计原理，利用Design Expert 8.0.6.1软件设计了以加水倍数（因素A）、提取时间（因素B）、提取次数（因素C）为自变量，以木犀草苷转移率及提取液的浸膏得率的综合评分为考察指标，进行三因素、三水平响应面法试验。因素及水平见表5，响应面设计方案及试验结果见表6，模型分析及方差分析结果见表7。

进行多元回归拟合分析，得综合评分对3个因素的二次多项回归方程为R1＝82.92＋7.94 A＋0.39B＋21.81 C-5.13 AB＋2.75 AC-1.48 BC-11.93 A2-1.78B2-9.21 C2。由表6可知，加水倍数和提取次数对水煎液提取的影响极显著，而交互项（AB，AC，BC）均无显著影响。二次项中，A2及C2对水煎液提取的影响极显著。模型决定系数R2为0.938 0，模型的失拟项F＝6.26，显著性水平P＝0.054 3＞0.05，失拟项并不显著，表明此模型拟合效果好，可很好地反映综合评分与3个因素的关系。综上所述，对综合评分影响强弱顺序为C＞A＞B。

表5 响应面试验因素水平表Tab.5 The factors and levels of the response surface methodology

表6 响应面试验设计方案与结果Tab.6 Design and results of the response surface methodology

表7 模型分析及方差分析结果Tab.7 Results of model analysis and ANOVA

2.3.2 响应面图分析

响应面三维图［11］见图2。

由图2 A可见，提取时间为0.5～1.0 h时，综合评分随着加水倍数的增大而逐渐升高，当提取时间超过1 h时，综合评分随加水倍数的变化而呈缓慢升高-降低的趋势；加水倍数为10～15倍时，综合评分随提取时间的延长而呈明显升高趋势，而当加水倍数超15倍时，综合评分随提取时间的延长呈升高-降低趋势。

由图2 B可见，加水倍数和提取次数对综合评分的影响较大。当加水倍数为10～15倍时，综合评分随提取次数的增加而显著升高；提取次数为1～2次时，综合评分随加水倍数的增加而升高，提取次数超过2次时，综合评分随加水倍数的增加而呈缓慢升高-降低的趋势。

由图2 C可见，响应曲面图所呈现的曲面较平滑，表示此交互项的作用并不明显，但也有一定协同作用。

2.3.3 验证试验

为保证试验的可行性，将上述工艺条件修正为：加18倍水，提取3次，每次0.8 h。按此条件进行电热套加热圆底烧瓶内回流提取六月雪-草药对中木犀草苷试验和浸膏试验，实测综合评分平均值为97.56分，RSD为1.24%，数据稳定，且与预测值相比，相对误差较小，表明建立的模型和实际情况基本吻合。

2.4 浸膏得率

取供试品溶液分别精密量取5mL，置已干燥至恒重的蒸发皿，水浴蒸干。再于105℃干燥3h，立即置干燥器中静置冷却30min。然后迅速精密称量，记录，并计算浸膏得率。

2.5 两种试验方法比较

由前文可知，按最优工艺条件提取时，响应面法所得综合评分高于正交试验法。正交试验中，3个因素中仅提取次数对综合评分有显著影响（P＜0.05），在响应面法中提取次数和加水倍数均对综合评分有显著影响。表明响应面法相对更能体现多因素与响应值间的关系。

正交试验法相较于响应面法，试验组数少，更简单易行，但有一定局限性；响应面法试验组数较多，但更加精确，三维图分析更直观，预测能力更强，得率也更高。响应面法依据试验结果拟合出模型来进行工艺优化，是在一个连续区域内筛选的最优方案，这可能是响应面法与正交试验法相比更能精确地优化提取工艺的原因［12］。但响应面法需通过更多试验组合来进行模型拟合及响应值预测，其工作量要远大于正交试验法［13］。因此，对于影响因素较少且不需太精确的工艺可使用正交试验法进行优选，但对于影响因素较多且各因素间关系较复杂的工艺则建议使用响应面法试验进行优化。