去甲斑蝥素增强人卵巢癌SKOV3 细胞对顺铂敏感性的机制研究

冯晓丹，毛 雪，王 英，董 秀*

（1.辽宁中医药大学中西医结合学院，沈阳 110847；2.辽宁中医药大学中医药创新工程技术中心，沈阳 110847）

卵巢癌是一种具有复杂分子和基因变化的异质性疾病，由于其缺乏有效预防措施、筛查工具及无症状发展的特点，使其多在癌症晚期才得以确诊，且极易在根治性手术和化疗后复发，故在妇科恶性肿瘤中病死率极高[1]。顺铂（cisplatin，DDP）是第一代铂类抗癌药物，对于包括卵巢癌在内的多种癌症均有显著的抗癌作用，临床运用广泛，但顺铂的内源性和获得性耐药极易造成患者后期疗效不佳，增加复发风险，而对正常细胞过高的毒副作用，也限制了顺铂的临床用药，故顺铂与其他抗癌药物联合治疗已成为许多癌症的新治疗策略[2]。去甲斑蝥素（norcantharidin，NCTD）是虫类中药提取物斑蝥素的衍生物，是近年来抗癌药物的新起之秀，其多靶点、增强免疫反应[3]、逆转耐药[4]等优势，是与顺铂联合用药的较好选择。本实验将应用流式细胞分析、荧光染色和Western blot 方法检测去甲斑蝥素能否增强顺铂对卵巢癌SKOV3 细胞敏感性，为临床用药提供新的治疗策略和依据。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂 人卵巢癌细胞株（SKOV3）购于中科院上海细胞库去甲斑蝥素（N8784）；顺铂（货号：P4394-25MG）（美国Sigma 公司）；胎牛血清（FBS）、PBS 磷酸盐缓冲液、RPMI-1640 培养液（美国Hyclone 公司）；MTT（货号：M8180），二甲基亚砜DMSO（货号：D8372），SDS-PAGE 凝胶制备试剂盒（货号：P1200），普通RIPA 裂解液（组织/细胞）（货号：R0020），BCA 蛋白浓度测定试剂盒（货号：PC0020）购于北京索莱宝科技有限公司；Annexin-FITC/PI 凋亡检测试剂盒（KC0001）购于ImmunoWay Biotechnology；Mito-Tracker Green（线粒体绿色荧光探针）（货号：C1048）购于中国碧云天生物技术有限公司。

1.2 细胞培养方法 将人卵巢癌细胞珠SKOV3 接种于含10%胎牛血清的RPMI-1640 培养液的细胞瓶中，放入5% CO2、37 ℃的二氧化碳培养箱培养，在培养过程中观察细胞形态、生长状态和细胞数量，及时换液、传代，适时进行冻存，保留实验备用。

1.3 MTT 法检测联合用药对SKOV3 细胞活性的影响 将细胞消化，制成单细胞悬液，计数后按2 000 个/孔，200 uL/孔接种于96 孔培养板内。次日，按正常对照组、去甲斑蝥素30 μmol/L 组，顺铂10 μg/mL组、去甲斑蝥素30 μmol/L+顺铂10 μg/mL 组依次加药，37 ℃、5%CO2条件下培养24 h，48 h，72 h。取出96孔培养板，避光下，每孔加入MTT 工作液25 uL，继续培养4 h。吸出孔中培养液，每孔加入DMSO 150 uL，摇床上震荡10 min，用酶标仪在490 nm 测定其吸光度值。抑制率（%）=（A490对照-A490给药）/（A490对照-A490空白）× 100%

1.4 流式细胞术检测细胞凋亡率 将SKOV3 卵巢癌的单细胞悬液以5×105个细胞/孔的密度接种于6 孔细胞板中培养。次日，待细胞贴壁后按1.3 进行分组加药，计时至指定时间，将原细胞培养液吸出保留，用特定胰蛋白酶（不含EDTA）消化，加入保留的原培养液吹打，用以制成细胞悬液。将细胞悬液以1 000 r/min离心5 min，弃上清，加PBS重悬计数。离心，以400 μL Binding Buffer 悬浮细胞，细胞密度为每毫升1×106个。加入5 μL 的Annexin V-FITC 结合液，4 ℃，避光，15 min。加入10 μL 的PI 染色液，4 ℃，避光，5 min。室温下放摇床上震荡避光孵育15 min，而后用流式细胞仪进行检测。

1.5 荧光显微镜观察细胞线粒体形态变化和分布 取对数生长期的SKOV3 细胞，经洗涤、消化后按照每孔400 μL 细胞悬液约8 000 个细胞接种48 孔板。次日，按1.3 加药处理，每孔给药400 μL。在药物作用指定时间后吸出原培养液，加入提前37 ℃预温培育的终浓度为200 nM 的Mito-Tracker Green 工作液，培养箱避光孵育40 min，去除Mito-Tracker Green 工作溶液，加入37 ℃预温培育的新细胞培养液，在荧光显微镜下进行观察、拍照、记录。

1.6 免疫印迹法检测蛋白表达 将细胞悬液以浓度5×105个细胞/皿接种于细胞培养皿中，放入培养箱培养。次日，按1.3 分组加药，药物作用指定时间后，在冰上经PBS 淋洗、裂解液裂解后提取蛋白。用BCA试剂盒测定蛋白浓度，蛋白变性后冻存待用。将变性的等量蛋白加入SDS-PAGE 凝胶孔中。用12% SDSPAGE 凝胶电泳分离蛋白质，分离完毕后以湿转的方式将蛋白转印至硝酸纤维素膜上。将膜放入5%的脱脂牛奶中，室温封闭1 h，TBST 清洗2 次，加入一抗孵育，放置4 ℃冰箱中，孵育过夜。次日，用TBST洗膜4 次，每次10 min，添加二抗，室温孵育1 h 。加入ECL 发光液后曝光，扫描记录图像。

1.7 统计学方法 采用 SPSS 22.0 统计学软件进行统计分析，计量资料采用均数±标准差（）表示。各组间数据比较应用单因素方差分析，以P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 去甲斑蝥素联合顺铂对卵巢癌细胞的生长抑制作用 分别加入去甲斑蝥素（30 μmol/L）、顺铂（10 μg/mL）和去甲斑蝥素（30 μmol/L）+顺铂（10 μg/mL）作用于卵巢癌细胞，分别于24、48、72 h 检测药物诱导的细胞毒性作用。如图1 所示，去甲斑蝥素和顺铂联合用药后，去甲斑蝥素可有效提高卵巢癌细胞对顺铂的敏感性，在24 h 的生长抑制作用最为理想。

图1 NCTD 联合顺铂对卵巢癌细胞的生长抑制作用

2.2 去甲斑蝥素联合顺铂对卵巢癌细胞凋亡的影响 流式细胞术结果显示，在早期凋亡中，去甲斑蝥素能明显增强顺铂诱导卵巢癌细胞凋亡作用。相较于去甲斑蝥素（30 μmol/L）、顺铂（10 μg/mL）单独用药组，去甲斑蝥素与顺铂联合用药组（30 μmol/L+10 μg/mL）的细胞凋亡率明显升高。见图2，图3。

图2 去甲斑蝥素联合顺铂用药的流式分析结果

图3 去甲斑蝥素联合顺铂用药对细胞凋亡的影响（，n =3）

2.3 去甲斑蝥素联合顺铂对卵巢癌细胞线粒体形态的改变 在用Mito-Tracker Green 特异性标记去甲斑蝥素（30 μmol/L）、顺铂（10 μg/mL）和去甲斑蝥素+顺铂（30 μmol/L+10 μg/mL）用药后卵巢癌细胞中的线粒体发现，与正常对照组细胞中线粒体形态相比，去甲斑蝥素（30 μmol/L）与顺铂（10 μg/mL）单独用药组出现少部分呈点块状形态的线粒体，而去甲斑蝥素与顺铂联合用药组细胞中点块状线粒体数量明显增加，聚集分布于核周，具有显著差异性，提示去甲斑蝥素促进了顺铂对卵巢癌细胞线粒体形态的改变，见图4。

2.4 去甲斑蝥素与顺铂联合用药对卵巢癌细胞中procaspase-3 蛋白表达的影响 通过蛋白免疫印迹的方法检测用药后卵巢癌细胞中procaspase-3 蛋白表达，发现与正常对照组比较，在去甲斑蝥素（30 μmol/L）与顺铂（10 μg/mL）组中均出现不同程度的procaspase-3蛋白表达下降，而去甲斑蝥素与顺铂（30 μmol/L+10 μg/mL）联合用药组中procaspase-3 蛋白表达下降程度增加，见图5。

图4 去甲斑蝥素联合顺铂对卵巢癌细胞线粒体形态的改变（线粒体荧光染色）

图5 去甲斑蝥素联合顺铂用药对procaspse-3 表达的影响

3 讨论

随着医学技术的进步，有了更好的手术技术和更多的化疗方案，但临床目前使用的对卵巢癌一线化疗反应良好的铂类化合物和紫杉烷类药物，仍会在大多数患者中出现复发和化疗耐药现象[5]。探索改善一线治疗药物疗效和化疗药物后期疗效的方法势在必行。凋亡是指在多种基因调控下细胞主动死亡的过程[6-8]，在清除不稳定基因或异常生长的细胞方面中起着至关重要的作用，是机体发育和维持体内平衡的重要途径。通常，癌症的发生多与癌细胞避开凋亡这一程序性死亡途径相关[9]，故抗癌药物多是通过诱导肿瘤细胞凋亡、缩小瘤体实现抗癌的目的[10-12]。去甲斑蝥素是虫类中药斑蝥提取物斑蝥素的衍生物，对于多种癌细胞均有显著的抑制作用。去甲斑蝥素诱导肿瘤细胞凋亡的方式有多种，既可以触发线粒体途径诱导黑色素瘤[13]、人前列腺癌[14]和胃癌[15]细胞凋亡，又可以引发内质网应激诱导人肾癌[16]细胞凋亡。实验[17]证明去甲斑蝥素能通过抑制c-met 蛋白的表达逆转肺癌细胞A549/DDP 细胞对顺铂耐药，增强了肺癌细胞对顺铂的敏感性。

本课题组前期实验旨在验证去甲斑蝥素对卵巢癌SKOV3 细胞的抑制作用，当去甲斑蝥素作用于卵巢癌细胞后可使促凋亡蛋白 Bax 表达水平上升，抗凋亡蛋白 Bcl-2 表达水平下调以及procaspase-3 的表达降低，同时还可以通过介导卵巢癌细胞中活性氧（reactive oxygen species，ROS）的产生引起G2/M 期的调控因子p21 蛋白表达上调和cyclin B1 蛋白表达下调，调控细胞周期，诱导卵巢癌细胞凋亡[18]。本研究发现，去甲斑蝥素能有效促进顺铂诱导卵巢癌细胞凋亡，抑制细胞活性。这一结果与郭纪伟等[19]在去甲斑蝥素作用于肺癌细胞实验中结果相同，即去甲斑蝥素增强了肿瘤细胞对顺铂的敏感性。在用Mito-Tracker Green 线粒体绿色荧光探针染色实验中，去甲斑蝥素和顺铂联合用药可明显破坏细胞内线粒体形态，可能与去甲斑蝥素作用于卵巢癌细胞后ROS 水平升高，Bax/ Bcl-2 比率上调诱发线粒体损伤相关。在既往的研究中显示，高水平的ROS 可以引发线粒体损伤，介导线粒体凋亡途径的，ROS 可引发线粒体膜通透性转运孔开放，进而引起线粒体跨膜电位降低，释放细胞色素C，引发Caspase 的级联反应，诱导肿瘤凋亡[20]。Bax/Bcl-2 比率上调可以引发线粒体膜电位崩溃，释放细胞色素C，活化Caspase 引发级联反应[21-22]。故可从以上2 个方面，对去甲斑蝥素联合顺铂用药损伤卵巢癌细胞线粒体机制进行后续实验补充证明。

Caspase 家族在细胞凋亡的起始和执行中都发挥重要作用，其中就包含第一个被信号激活的启动者Caspase（Caspase-2，-8，-9 和-10）和执行凋亡任务的执行者Caspase（Caspase-3，-6 和-7），许多传统的癌症疗法都是通过间接激活这些Caspases 来诱导细胞凋亡以清除癌细胞[23-24]。研究显示在大多肿瘤细胞中，如淋巴瘤、白血病等，由于凋亡被抑制，凋亡的执行者Caspase-3 的酶原procaspase-3，会在肿瘤中出现过表达的现象，通常Caspase-3是以procaspase-3的形式存在，只有在接受到凋亡信号时才会被活化为Caspase-3 执行凋亡指令[25-26]。本实验免疫印迹结果显示与对照组相比，去甲斑蝥素、顺铂组均可减少细胞内procaspase-3蛋白的表达，顺铂和去甲斑蝥素联合用药显著降低了细胞内procaspase-3 蛋白的表达，抑制了肿瘤的发生，提示联合用药后药物可能依赖Caspase 途径诱导卵巢癌细胞凋亡。

综上所述，去甲斑蝥素在卵巢癌的体外实验中，可促进顺铂对卵巢癌细胞的抑制作用，为临床去甲斑蝥素辅助顺铂治疗卵巢癌提供了新的理论依据和研究方向。