高强度超声波对溶菌酶抑菌活性的影响

宋凯

高强度超声波对溶菌酶抑菌活性的影响

宋凯

徐州生物工程职业技术学院 药品食品学院, 江苏 徐州 221006

为探究应用高强度超声波处理后溶菌酶抑菌活性的改变，本文以蛋清溶菌酶为原料，超声波（650 w，振幅30%，20 kHz，工作10 s，间隔10 s）分别处理5、10、15、20、25、30、45以及60 min，对比超声处理前后溶菌酶抑菌活性变化。结果表明：超声处理后，蛋清溶菌酶对大肠杆菌JM109的抑菌活性显著增强，而对金黄色葡萄球菌和溶壁微球菌的抑菌活性则明显降低，因此，适当的超声波处理会增强溶菌酶对大肠杆菌的抑菌活性。

超声波; 溶菌酶; 抑菌活性

溶菌酶（Lysozyme）别名球蛋白，同时被称作胞壁质酶。这是一种专门作用于微生物细胞壁的糖苷水解酶，广泛存在于人体多种组织器官及血液、汗液等分泌物中，绝大多数商品溶菌酶是从蛋清中分离纯化得到的。蛋清溶菌酶作为非广谱抗菌剂，主要作用于革兰氏阳性细菌，其主要成分肽聚糖能够水解细胞壁，但在革兰氏阴性菌内含量较少，且覆有一层较厚脂多糖类物质，因此对革兰氏阴性细菌几乎不产生抑制作用[1]。

超声波，在适当强度和频率下，发挥特有的空化作用，形成振荡反应，破坏物质之间相互引力的吸附作用[2]。严伟等[3]论述超声波提取技术时同时提出高强度超声波对酶有抑制作用；高纭芳[4]研究酪蛋白酶的蛋白结构时发现：随着超声强度的增强，其对蛋白结构的影响就越大。在超声强度为400 w时，蛋白结构就会变得疏松多孔；吴琼英等[5]将超声未处理数据与超声处理数据进行比较：超声波-离子液耦合预处理对蛋白质的高级结构有明显破坏作用，其疏水基团大量显于蛋白表面。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

溶菌酶（≥20000 U/mg），合肥博美生物科技有限责任公司。

菌株：大肠杆菌JM109，金黄色葡萄球菌，溶壁微球菌，北京索莱宝科技有限公司。

酵母粉，宜兴永信生物有限公司（江苏）；蛋白胨，盛思生化科技有限公司（上海）；氯化钠，氢氧化钠，中泰化学试剂有限公司（上海）；琼脂，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 主要仪器与设备

JY92-IIN超声波细胞粉碎机，XB-20雪花制冰机，新芝生物科技股份有限公司（宁波）；KYC-100C恒温摇床，维诚仪器有限公司(上海)；普析仪器有限责任公司(北京)；DNP9162E电热恒温培养箱，精宏实验设备有限公司(上海)；SW-CJ-IF单人双面超净台，安泰技术公司(苏州)；MILLI-Q超纯水仪；高压蒸汽灭菌器，致微仪器有限公司(厦门)；AIRAJ游标卡尺，易购五金工具有限公司(青岛)。

1.3 实验方法

1.3.1 溶菌酶超声样品预处理将0.2 mg蛋清溶菌酶溶于100 mL超纯水中，置于冰浴中，取未经超声处理的样品1 mL，设为对照组。同时在冰浴条件下，取已配置完成的溶菌酶25 mL于离心管中。分别在超声波（650 w，振幅30%，20 kHz，工作10 s，间隔10 s）条件下处理5 min，10 min，15 min，20 min，25 min，30 min，45 min，60 min，各取样1 mL，并保存8组样品数据[6-8]。

1.3.2 培养基配制酵母培养基，在高压灭菌锅(121 ℃，0.1 MPa)条件下灭菌20 min。液体培养基静置冷却待用；固体培养基内加入琼脂(1.5%)，在超净工作台中制作无菌平板(10 mL)若干，凝固待用。

1.3.3 菌悬液的制备在超净工作台上，用接种环分别挑取少量的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌JM109和溶壁微球菌接种于提前制备好的培养皿中，恒温培养箱（37 ℃）培养24 h。然后，用接种环分别挑取少量培养菌体，接种到液体培养基中，恒温摇床（37 ℃）培养12 h。取适量菌液根据十倍稀释法稀释，在一定浓度梯度下得到不同菌悬液。分别取稀释度为10-6、10-7和10-8的菌液平板培养，37 ℃，24 h，计菌落数，然后用灭菌去离子水稀释原菌悬液至106~107CFU/mL[9]。

1.2.4 抑菌圈的测定方法参考杯碟法[10]并略有修改。取20 mL熔化的固体培养基置于平板中，凝固后，取菌液浓度为106~107CFU/mL的三种菌悬液200 µL，分别均匀涂布于固体培养基中，10 min后，待菌液基本干透，在每个培养皿表面均匀放置5片滤纸片，用移液枪分别加入9种样品液，盖好培养皿，置37 ℃恒温培养24 h，测抑菌圈直径。样品实验分别重复3次，以计算平均值。

2 结果与分析

2.1 不同超声强度处理溶菌酶的抑菌圈直径

根据1.2.4的方法测定未处理的蛋清溶菌酶与经超声波处理后改变抑菌性的溶菌酶对3种菌的抑菌圈直径的影响。每个样品液重复实验3次，测其抑菌圈直径，结果见表1~3。

表 1 溶菌酶对金黄色葡萄球菌抑菌圈直径

从上表1可知，未经过超声处理的溶菌酶对金黄色葡萄球菌有抑菌活性，平均抑菌圈6.20 mm。且溶菌酶抑菌圈总体呈下降趋势，由此可见随着超声处理溶菌酶时间的延长，溶菌酶抑菌活性先增强后下降，具体情况详见图1。

表 2 溶菌酶对大肠杆菌JM109的抑菌圈直径

从上表2可知，未经过超声处理的溶菌酶对大肠杆菌JM109无抑菌活性，平均抑菌圈6.00 mm。而溶菌酶抑菌圈总体呈上升-持平-下降趋势，由此可见随着超声处理溶菌酶时间的延长，溶菌酶抑菌活性先增强后减弱，且在10 min出现最大值，具体情况详见图2。

表 3 溶菌酶对溶壁微球菌的抑菌圈直径

从上表3可知，未经过超声处理的溶菌酶对溶壁微球菌有明显抑菌活性，平均抑菌圈6.30 mm。而溶菌酶抑菌圈总体呈下降趋势，由此可见随着超声处理溶菌酶时间的延长，溶菌酶抑菌活性整体逐渐下降，具体情况详见下图3。

2.2 不同超声强度处理溶菌酶抑菌曲线变化

根据表1-3数据所示平均值，作折线图，如下

图 1 不同超声强度处理溶菌酶对金黄色葡萄球菌活性的影响

图 2 不同超声强度处理溶菌酶对大肠杆菌JM109活性的影响

图 3 不同超声强度处理溶菌酶对溶壁微球菌活性的影响

根据图1~图3，在超声时间为0 min时，溶菌酶对金黄色葡萄球菌、溶壁微球菌均有抑菌活性，且对溶壁微球菌抑菌活性最高，而对大肠杆菌JM109基本无明显抑菌活性。在超声时间为5 min时，溶菌酶对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌JM109和溶壁微球菌的抑菌活性都有所增强，但三种菌抑菌活性的数值略有不同，金黄色葡萄球菌增强的数值最大，为0.34 mm。在超声时间为60 min时，溶菌酶对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌JM109和溶壁微球菌的抑菌活性都逐渐消失。

综上所述，经过超声波处理后，溶菌酶对大肠杆菌JM109的抑菌活性有显著增强，而对金黄色葡萄球菌和溶壁微球菌的抑菌活性则明显降低。

3 讨论

在超声处理时间为5 min时，溶菌酶对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌JM109和溶壁微球菌的抑菌活性都有上升，而随着超声波处理时间延长，抑菌活性呈下降趋势。处理时间60 min时，溶菌酶对三种菌的抑菌活性消失。导致溶菌酶抑菌活性变化的原因可能是超声波会引起蛋白质二级结构的改变。随着超声处理时间的延长，溶菌酶的蛋白高级结构开始发生改变，蛋白表面疏水性氨基酸残基增加，溶菌酶对革兰氏阴性菌的穿透性增强。随着超声处理时间的延长，蛋白高级结构逐渐被打乱，活性中心收到破坏，抑菌活性消失。

陶树兴等[11]研究了超声波处理与溶菌酶单独处理对嗜热脂肪芽孢杆菌抑制作用的影响，发现超声波处理能增强溶菌酶的抑菌活性。罗彩林等[12]对比超声波处理溶菌酶和未经超声处理溶菌酶的活性以及西施舌活性物质的变化，发现当超声波为150 w，15 min时，超声波处理未破坏溶菌酶活性。前者与我们的实验得到了类似的结果，后者与我们的结论形成对比，相同超声时间下，超声波强度较低时对溶菌酶活性没有影响，而高强度超声波对溶菌酶抑菌活性有影响。同时发现超声强度和超声时间这些相关参数的改变，某种程度上会引起溶菌酶抑菌活性的改变。

4 结论

一定强度的超声波（650 w，振幅30%，20 kHz，工作10 s，间隔10 s）处理可以有效增强溶菌酶对三种菌株的抑菌活性，其中金黄色葡萄球菌和溶壁微球菌的最佳处理时间为5 min，而大肠杆菌JM109的最佳处理时间为10 min。在超声波处理时间为10 min时，溶菌酶对金黄色葡萄球菌的抑菌活性没有下降。因此，适量的超声波处理可拓宽溶菌酶的抑菌图谱。

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Effect of High Intensity Ultrasound on Antibacterial Activity of Lysozyme

SONG Kai

221006,

To investigate the change of antibacterial activity of Lysozyme after high intensity ultrasonic treatment, this paper used egg white Lysozyme as raw material, ultrasonic treatment (650 w, amplitude 30%, 20 kHz, working 10 s, interval 10 s) was conducted for 5, 10, 15, 20, 25, 30, 45 and 60 min, respectively. Results showed after ultrasound treatment, the antibacterial activity of egg white Lysozyme againstJM109 was significantly enhanced, while the antibacterial activity of egg white Lysozyme againstandwas significantly decreased. Therefore, proper ultrasonic treatment can enhance the antibacterial activity of Lysozyme against.

Ultrasound; Lysozyme; antibacterial activity

Q814.9

A

1000-2324(2021)02-0266-04

10.3969/j.issn.1000-2324.2021.02.019

2020-02-05

2020-03-21

徐州市科技计划项目:人溶菌酶重组改性及抑菌活性研究(KC16SG274)

宋凯(1977-),男,硕士,副教授,主要从事生物工程专业教学与研究工作. E-mail:13505211235@139.com