病毒样颗粒疫苗在疾病防治中的研究进展①

施逸凡 陶 冶 石艳春 魏 鹏 北京中医药大学中医学院北京100029

病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)是由1种或多种病毒结构蛋白通过自组装形成的纳米级颗粒,在形态上类似于天然病毒,但通常不含亲本病原体遗传物质[1]。根据其亲本病毒结构,VLPs可分为2类:无包膜VLPs和包膜VLPs,无包膜VLPs通常由1个或多个可自组装成微粒的组分构成,且不包含任何宿主成分,包膜VLPs则是由多组分的靶向病原体和宿主膜组分形成的复杂结构,与病原体形态相似[2]。由于此种结构特点,VLPs具有同天然病毒类似的抗原展示方式和高免疫原性,并具有结构稳定、生物相容性高、颗粒均一性好、颗粒载体装载率大、不含病毒基因、安全性高等优势。

作为新型纳米生物材料,VLPs的应用范围因其自身性能特点不断拓展,在生物医学特别是疫苗研发领域尤其突出,疫苗研发也是VLPs最早及最广泛的应用领域之一。VLPs不仅可整合同源或异源多聚体抗原,且与真实病毒结构相似,可有效实现抗原提呈进而诱导获得性免疫治疗策略。此外,采用不含遗传物质的VLPs生产的疫苗相较于减毒疫苗安全性更高。因此,VLPs为疫苗开发及生产提供了新思路和新方法,在新型亚单位疫苗制备中极具潜力。目前,多种VLPs制备的疫苗已获批上市,如HBV疫苗(Engerix-BV®、Enivac HBV®等)、H1N1疫苗(Inflexal®V)、HPV疫苗(Gardasil®、Cervarix®)等[3]。本文综述VLPs疫苗的设计和应用原理,对其在免疫防治中的应用现状进行重点梳理,并对其在突发传染病如新型冠状病毒肺炎(COVID-19)等防控中的应用前景进行展望。

1 VLPs的制备及表达系统

VLPs的制备过程一般包括以下步骤:病毒结构基因构建与克隆、宿主表达系统选择、分离纯化、分析鉴定等[4]。VLPs常用表达系统包括大肠杆菌表达系统、酵母表达系统、杆状病毒/昆虫细胞表达系统、植物细胞表达系统、哺乳动物细胞表达系统、无细胞表达系统等(表1)[5]。采用以上表达系统制备的VLPs在生物相容性、热稳定性、靶向性、免疫原性等方面表现良好,在生物医学领域备受关注[3]。目前已有100余种VLPs被制备及鉴定,图1为其中4种来源于不同病毒种属的VLPs晶体结构。

2 VLPs疫苗的构建与应用原理

一种新疫苗的开发通常需要15～20年及数十亿美元的持续投入,过去40年间,为更容易和低成本设计新抗原和佐剂并将其纳入新的疫苗配方,包括VLPs疫苗技术在内的多种新技术应运而生[9]。传统疫苗如减毒疫苗、化学灭活疫苗、类毒素等亚单位疫苗均存在不同程度的缺陷。减毒病毒在免疫功能低下的受试者体内可能会重新激活毒力状态,或具有严重副作用；化学灭活疫苗或亚单位疫苗在安全性上有所提高,但免疫原性较低仅能刺激较弱的免疫反应,无法获得终身免疫,需多次注射[10]。因此,VLPs疫苗高效的抗原呈递方式受到广泛关注,有望解决长期存在的疫苗安全性与免疫原性问题。

VLPs发挥免疫原性基于其粒径大小与立体结构的特性。VLPs与病原体大小相似(20～200 nm),可有效进入淋巴管并引流至淋巴结,从而传送至相关的免疫细胞群体及其细胞间隔[11-12]。VLPs具有与病原体相似的几何构象和高度重复显示的抗原表位,这种抗原表位既可以是未经修饰的1种或多种同源病原体抗原,也可以是通过基因融合或化学结合方式进行修饰表达的异源抗原或表位肽[6,11]。灵活多样的抗原表达方式使VLPs既可作为预防性疫苗,通过表达外源性免疫原性分子诱导机体产生对特定病原体的获得性免疫,又可作为治疗性疫苗,通过诱导针对机体内源性分子的特异性抗体产生在癌症、自身免疫性疾病等治疗中发挥优势作用[3]。

图1 不同病毒种属的VLPs晶体结构[7-8]Fig.1 Crystal structures of VLPs of different virus species[7-8]

表1 制备VLPs的不同表达系统比较[1-2，4，6]Tab.1 Comparison of different expression systems for VLPs preparation[1-2，4，6]

接种VLPs疫苗后可通过多种潜在方式刺激固有和适应性免疫应答。VLPs疫苗既可直接诱导B细胞免疫球蛋白受体交联和B细胞激活,也可作为外源性抗原被树突状细胞(dendritic cell,DCs)等专职抗原提呈细胞的模式识别受体(pattern recognition receptor,PRR)识别并摄取,通过MHCⅡ类分子提呈给CD4+T细胞活化产生滤泡辅助性T细胞(helper T cell,Tfh),从而诱导特异性效应B细胞活化和体液免疫,也可通过MHCⅠ类分子以“交叉呈递”形式呈递给CD8+T细胞,诱导机体特异性细胞免疫保护机体(图2)[1,13]。这种“交叉呈递”的抗原提呈方式使VLPs疫苗相较于传统疫苗具有明显优势,通常情况下灭活疫苗或亚单位疫苗作为外源性抗原无法感染细胞或在细胞内表达抗原,对CD8+T细胞的激活能力较差[13]。此外,某些VLPs通过包裹核酸作为佐剂,可通过病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMP)作用于细胞因子信号转导相关的Toll样受体的配体,进一步增强免疫应答[11]。

3 VLPs疫苗在疾病预防与治疗中的应用

基于上述原理及VLPs在疫苗领域的明显优势,目前已有针对HBV、HPV、HEV、疟疾、流感的VLPs疫苗相继获批上市,同时针对多种病毒、疾病的预防性疫苗和治疗性疫苗处于临床试验阶段。

图2 基于VLP疫苗诱导先天和适应性免疫原理示意图Fig.2 Schematic diagram showing potential ways the VLP-based vaccine can stimulate innate and adaptive immune responses

3.1 基于VLPs的乙肝病毒疫苗 1981年,研究者利用从感染者血液中纯化出的乙肝表面抗原颗粒构建了第一代基于VLPs的血浆源乙型肝炎疫苗,如Heptavax-B®[10]。随后,几家疫苗制造商采用重组DNA技术在转染酵母(Saccharomyces cerevisiae,Pichia pastoris,Hansenula polymorpha)中高效表达HBsAgS,使酵母源乙型肝炎疫苗得到发展为“第二代”乙型肝炎疫苗。二代疫苗克服了一代疫苗受血浆供应的限制和安全性缺陷问题,并在世界范围内显著降低了HBV的发病率[14]。三代疫苗Bio-Hep-BTM等则是一种酵母或哺乳动物细胞来源的重组Pre-S1/Pre-S2/S乙型肝炎疫苗,可按不同比例表达HBsAgS、HBsAgM、HBsAgL并形成VLPs。与传统真核酵母细胞来源的疫苗相比,该疫苗具有高度免疫原性,可在较低剂量以更快的速度诱导产生更高的乙型肝炎病毒血清保护率,并具有更高的抗HBs水平。研究表明,该疫苗在干预持续性乙肝病毒感染方面也可能有效[15]。同时,HBsAg颗粒表现出接受和呈递外源抗原序列的良好能力,可作为嵌合抗原VLPs平台用于构建预防或治疗脊髓灰质炎、疟疾、HIV、登革热等疾病的疫苗[14]。

3.2 基于VLPs的人乳头瘤病毒疫苗 人乳头瘤病毒(HPV)是一种极为常见的性传播病毒,其高危Ⅱ型(如HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59)被认为是生殖系统癌症(如宫颈癌、外阴癌、阴道癌、阴茎癌和肛门癌)及部分头颈部癌症的主要病因[16]。目前FDA已批准3种基于VLPs的HPV疫苗,分别是二价疫苗(Cervarix®,葛兰素史克公司)、四价疫苗(Gardasil®,默沙东公司)及九价疫苗(Gardasil9®,默沙东公司),均采用纯化的L1蛋白制备[16]。2006年,第一种HPV疫苗Gardasil®在美国获批,该疫苗由HPV 6型、11型、16型和18型的主要衣壳蛋白L1自组装而成,用于预防宫颈癌、生殖系统癌前病变和生殖器疣。2014年,四价Gardasil®被九价Gardasil9®所取代,增加覆盖了HPV 31型、33型、45型、52型和58型,具有更高的L1抗原载量和更多的佐剂[17]。针对世界范围内优势流行株的二价Cervarix®(16型、18型)于2007年获批,是3种疫苗中抗原浓度最低,且含有1种增强免疫原性的高级佐剂AS04,可刺激机体产生更高血清中和抗体应答率及更持久的抗体反应[18]。此外,多种以E1、E2、E6和E7癌蛋白为靶点的HPV治疗性疫苗也已进入临床试验阶段[16]。

3.3 基于VLPs的戊肝病毒疫苗 一次昆虫细胞表达的HEV衣壳蛋白重组肽可保护灵长类动物免受急性肝炎侵袭的研究证实,衣壳蛋白中存在中和表位,为重组HEV疫苗的开发奠定了基础[19]。2011年,万泰生物制药有限公司研发的基于VLPs的戊型肝炎疫苗益可宁®在中国获批用于人体,疫苗基于大肠杆菌表达的氨基酸序列p239(与HEV衣壳蛋白pORF2的aa 368-606对应)[19]。实验证明,益可宁®不仅在中国16～65岁的患者中具有良好的安全性及有效性,也在65岁以上人群中具有免疫原性及良好的耐受性[20]。

3.4 基于VLPs的疟疾疫苗 2015年,基于VLPs的疟疾疫苗RTS,S/AS01获批,成为当时世界上最先进的抗恶性疟原虫疟疾候选疫苗[21]。RTS,S/AS01以乙型肝炎表面抗原为基质载体,从恶性疟原虫的环孢子体(CS)蛋白中获得抗原表位,并联合应用AS01作为佐剂[14]。该疫苗在撒哈拉以南非洲流行地区儿童中有效率高达50%,但对首次感染者缺乏显著疗效,仍有改善空间[22]。而英国詹纳研究所研发的R21由CS多肽-乙型肝炎表面抗原(HBsAg)融合蛋白形成VLPs,与RTS、S相比具有更高的免疫原性[23]。

3.5 基于VLPs的流感疫苗 基于VLPs的流感疫苗是由流感病毒免疫原性激活物(血凝素HA和神经氨酸苷酶NA)其一或两者共同组成,以目前上市的Inflexal®(Crucell Berna Biotech公司)为例,与基于DNA的流感疫苗相比,其优势在于构架中含有参与宿主流感感染保护的NA。2009年抗击H1N1病毒的经验表明,基于传统技术的流感疫苗生产工艺复杂且生产周期较长,疫苗制备和供应推迟导致H1N1病毒蔓延而基于VLPs的流感疫苗在研发过程中生产简易快速[24]。目前临床研究阶段的VLPs流感疫苗主要为三价疫苗(甲型流感病毒H1N1型、H3N2型、乙型流感病毒的1个分支)和四价疫苗(甲型流感病毒H1N1型、H3N2型和乙型流感病毒的2个分支),未来将开发包含多种HA和NA亚型蛋白的VLPs疫苗,如多价HA亚型(H5.H7.H9)VLP疫苗[25]。

3.6 其他临床试验阶段VLPs疫苗概述 VLPs疫苗除可应用于HBV、HPV、HEV、疟疾、流感等预防外,多种基于VLPs的预防性或治疗性疫苗已进入临床试验阶段,主要针对诺如病毒、基孔肯雅病毒、BK多瘤病毒、人类细小病毒B19等,同时针对阿尔兹海默症、恶性肿瘤(黑色素瘤、乳腺癌)、尼古丁依赖、高血压等疾病治疗与病情控制的多种VLPs疫苗也已进入临床试验阶段(表2)。

4 VLPs疫苗在新发传染病疫苗中的应用

VLPs疫苗开发周期较短的特点在新发传染病的防治中具有极大潜力。如2020年3月11日被世界卫生组织宣布为大流行的COVID-19疫苗研发中,尽管目前尚未有新冠疫苗获批上市,但林金钟、徐颖洁等通过以不同比例配比经修饰的含有S、M和E基因的mRNA转染细胞,获得了具有明显冠状病毒特征的VLPs,且可明显观察到该VLPs可成功表达新型冠状病毒的特征性抗原S糖蛋白,且以三聚体形式密集排布于VLP表面,为制备有效COVID-19 VLPs疫苗创造了条件[42-43]。与此同时,诺瓦瓦克斯医药公司(Novavax)宣布开发了1种基于新型冠状病毒S糖蛋白和该公司专有佐剂Matrix-M的VLPs疫苗,并已进入动物实验阶段[44]。2020年3月16日,上海市科委在新闻发布会上表示,小鼠在VLPs疫苗的免疫实验已产生特异性抗体,后续研究将继续在上海巴斯德研究所进行。

在COVID-19大流行前,世界范围内曾出现过2种可引起人类死亡的冠状病毒SARS-CoV和MERSCoV,分别导致严重急性呼吸综合征(SARS)和中东呼吸综合征(MERS)爆发。针对同属冠状病毒的疫苗开发中,VLPs疫苗同样扮演重要角色。2015年,Novavax成功表达出含有三聚体S蛋白的MERSCoV VLPs,将其与Matrix-M佐剂联用在小鼠和转基因牛中成功诱导出中和抗体,并证明通过将免疫牛血清单次注射给未免疫小鼠可产生对MERS-CoV的完全保护作用[44]。2016年,研究者将犬细小病毒VP2结构蛋白基因与MERS冠状病毒受体结合域蛋白融合自组装成嵌合VLPs,可激活小鼠特异性体液和细胞免疫反应,表明基于MERS-CoV受体结合域的VLPs疫苗在潜在暴发情况下是有潜力的预防手段[45]。

5 VLPs应用前景与展望

在疫苗开发领域,尽管VLPs疫苗具有下游生产成本较高、纯化和分离过程层析树脂较贵等需进一步改进的问题,但其优势显而易见[46]。VLPs疫苗的应用有望解决目前新型疫苗生产周期较长、开发成本较高、热稳定性较差、需高成本冷链储存和运输、部分疫苗免疫原性较低需多次注射等问题,并拓展了黏膜疫苗、口服疫苗的构建方式[3,5]。同时,VLPs作为一种新型纳米材料在多个领域也被广泛应用。在分子载体方面,相较于其他运载手段,VLPs在稳定性、分子大小及跨膜运输等方面表现出明显优势[49]；VLPs对目标宿主细胞的天然亲和力特性已被用于如基因治疗、靶向给药等细胞靶向应用[3]；在生物成像方面,VLPs与荧光染料或其他探针进行生物偶联也展现出较好的生物相容性,并可用于揭示病毒感染机制等基础研究[2,47]。

表2 临床研究阶段VLPs疫苗Tab.2 VLPs vaccines in clinical development

近年突发高致病性病毒逐渐呈长期存在和不断突变进化的趋势,值得疫苗开发领域人员关注。就冠状病毒来看,SARS-CoV在爆发后消失无踪,但MERS-CoV从2019年1月至2020年1月仍有221例病例出现,目前新型冠状病毒也逐渐呈现出与人类长期共存的可能性[48]。在这种情况下,新型疫苗的开发在突发传染病的防控中至关重要。VLPs疫苗在流感疫苗和冠状病毒疫苗开发中的成功案例为其在突发传染病预防中发挥更加重要的作用提供了有力证明,有理由将VLPs疫苗作为突发传染病疫苗设计的优先策略。