LINC00355调控miR-494-3p/CCND2对前列腺癌细胞增殖、侵袭、迁移的影响①
2021-05-27张建育李毅宁郭一泓福建医科大学附属第二医院泌尿外科泉州362000
张建育 李毅宁 郭一泓 穆 鑫 福建医科大学附属第二医院泌尿外科泉州362000
前列腺癌是临床常见恶性肿瘤之一,其发病率逐年升高,但前列腺癌发生及转移的分子机制尚未阐明[1]。长链非编码RNA(long non-coding RNA,LncRNA)在多种肿瘤中异常表达并可影响肿瘤细胞增殖、分化等过程[2]。研究表明LncRNA表达异常与前列腺癌发生及发展密切相关[3]。但关于其具体作用机制尚未阐明。长链非编码RNA(LncRNA LINC00355)在肿瘤中呈高表达并可促进肿瘤进展[4]。微小RNA-494-3p(microRNA-494-3p,miR-494-3p)在髓母细胞瘤中呈低表达,上调其表达可抑制肿瘤进展[5]。细胞周期蛋白HD2(cyclin-D2,CCND2)在卵巢癌中表达量升高,下调其表达可抑制肿瘤细胞迁移及侵袭[6]。生物学信息学分析显示LINC00355与miR-494-3p存在结合位点,miR-494-3p与CCND2存在结合位点,但LINC00355是否可通过调控miR-494-3p/CCND2参与前列腺癌发生及发展过程尚未可知。本研究主要探讨前列腺癌组织中LINC00355、miR-494-3p、CCND2的表达,探究LINC00355对前列腺癌细胞增殖、侵袭、迁移的影响,分析其对miR-494-3p、CCND2的调控作用,旨在为揭示前列腺癌发生及转移的分子机制奠定理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验试剂 前列腺癌细胞DU145购自美国ATCC细胞库；杜氏改良培养基(DMEM)、胎牛血清、胰蛋白酶购自美国Gibco公司；Lipofectamine2000与TRIzol试剂购自美国Invitrogen公司；反转录与qRT-PCR试剂盒购自美国Thermo Fisher公司；LINC00355小干扰RNA(si-LINC00355)(序列:ACGAUCUAUCGAUCGUAG)、乱序无意义阴性对照(si-NC)、miR-494-3p特异性寡核苷酸抑制剂(anti-miR-494-3p)(序列:GUUUGUUUUCACUAGUCUAGC)及其阴性对照(anti-miR-NC)、miR-494-3p寡核苷酸模拟物(miR-494-3p mimics)(序列:AGUCGAUCUACGUAGCUAGUCG)及阴性对照mimic NC序列(miR-NC)购自广州锐博生物科技有限公司；pcDNA3.1购自上海远慕生物科技有限公司；甲基噻唑基四唑(methylthiazolyl tetrazolium,MTT)、二甲基亚砜(dimethylsulfoxide,DMSO)、膜联蛋白V(Annexin V)-异硫氰酸荧光素(FITC)/碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)细胞凋亡试剂盒购自美国Sigma公司；Transwell小室购自美国Corning公司；Matrigel基质胶购自美国BD公司；兔抗人P21、上皮钙黏附素(E-cadherin)、基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinases-2,MMP-2)抗体购自美国CST公司；兔抗人CCND2抗体与辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔二抗购自武汉艾美捷科技有限公司。
1.1.2 前列腺癌组织及癌旁组织标本来源 收集2017年2月至2018年12月本院收治的36例前列腺癌患者为研究对象,所有患者均经病理证实为前列腺癌,年龄50～65岁,平均年龄(55.49±6.57)岁,术中切除前列腺癌组织及癌旁组织,置于-80℃超低温冰箱保存。本研究经本院伦理委员会批准,所有患者知情且签署同意书。
1.2 方法
1.2.1 细胞转染及分组 前列腺癌细胞DU145培养于含有10%胎牛血清的DMEM培养基,置于37℃、5%CO2培养箱中培养,取对数期DU145细胞,0.25%胰蛋白酶消化,制备细胞悬液,调整细胞密度为1×105个/ml,接种于24孔板(100μl/孔),待细胞生长融合至70%时参照Lipofectamine2000说明书进行转染,分别将si-NC、si-LINC00355、si-LINC00355与anti-miR-NC、si-LINC00355与antimiR-494-3p、si-LINC00355与miR-NC、si-LINC00355与miR-494-3p mimics共转染至DU145细胞,分别记作si-NC组、si-LINC00355组、si-LINC00355+antimiR-NC组、si-LINC00355+anti-miR-494-3p组、si-LINC00355+miR-NC组、si-LINC00355+miR-494-3p组。转染前2 h更换为不含血清的培养基,转染6 h后更换为含有10%胎牛血清的DMEM完全培养基,继续培养48 h收集细胞。
1.2.2 qRT-PCR检测LINC00355、miR-494-3p、CCND2 mRNA的表达水平 采用TRIzol法提取前列腺癌组织、癌旁组织及各组DU145细胞中的总RNA,Nanodrop2000c超微量分光光度计检测RNA浓度。参照反转录试剂盒将总RNA合成cDNA。LINC00355 F:5′-GTCTTGCTTTGTCACCCAGG-3′,R:5′-CTAACACTTTGGGCAGCGTT-3′；miR-494-3p F:5′-CTTCGGCAGCACATATACTAAA-3′,R:5′-TCGACTAGTCCAGCATGTCA-3′；CCND2 F:5′-ACTTGTGATGCCCTGACTGA-3′,R:5′-AAGTTGGGCACAGGTCGATA-3′；U6 F:5′-GCTTCGGCAGCACATATACT-3′,R:5′-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3′；GAPDH F:5′-AACGGATTTGGTCGTATTG-3′,R:5′-GGAAGATGGTGATGGGATT-3′,引物由上海生工生物工程股份有限公司设计合成。按照RT-PCR试剂盒配置反应体系,置于ABI 7500型荧光定量PCR仪中检测,反应条件:95℃2 min,95℃30 s,60℃30 s,72℃30 s,共40次循环。LINC00355与CCND2以GAPDH为内参,miR-494-3p以U6为内参,采用2-ΔΔCt法计算LINC00355、miR-494-3p、CCND2 mRNA相对表达。
1.2.3 MTT检测细胞增殖 收集各组对数期DU145细胞接种于96孔板(5×104个/孔),每组设置3个复孔,转染48 h时,每孔加入质量浓度为5 mg/ml的MTT溶液20μl,37℃培养箱继续培养4 h,1 300 r/min离心5 min,弃上清,加入150μl DMSO,室温振荡孵育5 min,酶标仪检测各孔吸光度值(490 nm),计算细胞增殖抑制率(%),细胞增殖抑制率=(1-实验组OD值/空白对照组OD值)×100%。
1.2.4 Transwell实验检测细胞迁移与侵袭 细胞迁移实验:收集各组对数期DU145细胞接种于24孔板Transwell小室的上室(5×104个/孔),Transwell小室的下室加入含有10%胎牛血清的培养液(600μl/孔),37℃培养箱内培养24 h,弃上清液,PBS洗涤,多聚甲醛固定20 min,PBS洗涤,加入0.1%结晶紫染液染色10 min,棉签擦拭未迁移的细胞,显微镜下观察迁移细胞数。细胞侵袭实验:预冷培养液按照9∶1的比例稀释Matrigel基质胶,加入24孔板Transwell小室的上室(40μl/孔),37℃培养箱内孵育5 h,后续实验步骤同细胞迁移实验,显微镜下观察侵袭细胞数。
1.2.5 双荧光素酶报告基因检测LINC00355靶向miR-494-3p及miR-494-3p靶向CCND2 starBase预测显示LINC00355与miR-494-3p存在结合位点,CCND2的3′UTR含有miR-494-3p的互补序列,采用基因定点突变技术突变结合位点,分别将含有结合位点与突变位点的片段克隆至pmirGLO载体得到野生型载体WT-LINC00355、突变型载体MUTLINC00355、野生型载体WT-CCND2、突变型载体MUT-CCND2,分别将 WT-LINC00355、MUTLINC00355、WT-CCND2、MUT-CCND2与miR-NC、miR-494-3p mimics共转染至DU145细胞。转染24 h后收集细胞,检测细胞相对荧光素酶活性。
1.2.6 Western blot检测CCND2、P21、E-cadherin、MMP-2蛋白表达 收集各组对数期DU145细胞,采用蛋白提取试剂盒提取细胞总蛋白并检测蛋白浓度。采用SDS-PAGE分离蛋白,分离的蛋白凝胶转移至PVDF膜,5%脱脂牛奶封闭2 h,加入蛋白一抗(1∶1 000),4℃孵育24 h,TBST洗涤,加入二抗(1∶5 000),室温孵育1 h,TBST洗涤,加入ECL,暗室内曝光显影,应用ImageJ软件分析各条带灰度值。
1.3 统计学处理 采用SPSS21.0统计学软件分析数据,计量资料以表示且均符合正态分布,两组间比较采用独立样本t检验,多组间比较采用单因素方差分析,以P＜0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 LINC00355、miR-494-3p、CCND2在前列腺癌组织和癌旁组织中的表达 与癌旁组织相比,前列腺癌组织中LINC00355与CCND2 mRNA的表达水平显著升高(P＜0.05),miR-494-3p的表达水平显著降低(P＜0.05),见表1。
2.2 抑制LINC00355对DU145细胞增殖、迁移、侵袭的影响 与si-NC组相比,si-LINC00355组LINC00355的表达水平显著降低(P＜0.05),细胞增殖抑制率显著升高(P＜0.05),迁移细胞数与侵袭细胞数显著减少(P＜0.05),P21、E-cadherin蛋白水平显著升高(P＜0.05),MMP-2蛋白水平显著降低(P＜0.05),见图1、表2。
表1 LINC00355、miR-494-3p、CCND2在癌旁组织和前列腺癌组织中的表达(，n=36)Tab.1 Expression of LINC00355，miR-494-3p，CCND2 in adjacent tissues and prostate cancer tissue(，n=36)
表1 LINC00355、miR-494-3p、CCND2在癌旁组织和前列腺癌组织中的表达(，n=36)Tab.1 Expression of LINC00355，miR-494-3p，CCND2 in adjacent tissues and prostate cancer tissue(，n=36)
Note:Compared with adjacent tissues,1)P＜0.001.
Groups LINC00355 miR-494-3p CCND2 mRNA Adjacent tissues 1.00±0.06 0.98±0.04 1.01±0.06 Prostate cancer tissue 2.37±0.081) 0.28±0.031) 2.14±0.071)t 82.000 84.000 73.539 P ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001
2.3 抑制LINC00355对DU145细胞中miR-494-3p、CCND2表达的影响 与si-NC组相比,si-LINC00355组细胞中miR-494-3p的表达水平显著升高(P＜0.05),CCND2 mRNA及蛋白表达水平均显著降低(P＜0.05),见图2、表3。
2.4 抑制miR-494-3p能减轻抑制LINC00355对DU145细胞增殖、迁移、侵袭的影响 与si-LINC00355+anti-miR-NC组相比,si-LINC00355+anti-miR-494-3p组miR-494-3p的表达水平显著降低(P＜0.05),细胞增殖抑制率显著降低(P＜0.05),迁移细胞数与侵袭细胞数显著增多(P＜0.05),P21、E-cadherin蛋白水平显著降低(P＜0.05),MMP-2蛋白水平显著升高(P＜0.05),见图3、表4。
图1 抑制LINC00355对DU145细胞中P21、E-cadherin、MMP-2蛋白表达的影响Fig.1 Effect of inhibition of LINC00355 on expressions of P21， E-cadherin and MMP-2 protein in DU145 cells
图2 CCND2蛋白的表达Fig.2 Protein expression of CCND2
表2 抑制LINC00355对DU145细胞增殖、迁移、侵袭的影响(，n=9)Tab.2 Effect of inhibition LINC00355 on proliferation，migration and invasion of DU145 cells(，n=9)
表2 抑制LINC00355对DU145细胞增殖、迁移、侵袭的影响(，n=9)Tab.2 Effect of inhibition LINC00355 on proliferation，migration and invasion of DU145 cells(，n=9)
Note:Compared with si-NC group,1)P＜0.05.
Groups LINC00355 Inhibition rate(%)Number of migrating cells Number of invasion cells P21 E-cadherin MMP-2 si-NC 1.02±0.06 0.11±0.01 136.00±9.14 86.00±7.42 0.19±0.02 0.24±0.03 0.77±0.05 si-LINC00355 0.35±0.041) 52.26±3.031) 61.00±6.081) 38.00±4.291) 0.65±0.041) 0.76±0.041) 0.29±0.031)t 27.874 51.633 20.496 16.801 30.858 31.200 24.696 P＜0.001 ＜0.05 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.0 01
2.5 miR-494-3p过表达能增强抑制LINC00355对DU145细胞增殖、迁移、侵袭的影响 与si-LINC00355+miR-NC组相比,si-LINC00355+miR-494-3p组miR-494-3p的表达水平显著升高(P＜0.05),细胞增殖抑制率显著升高(P＜0.05),迁移细胞数与侵袭细胞数显著减少(P＜0.05),P21、Ecadherin蛋白水平显著升高(P＜0.05),MMP-2蛋白水平显著降低(P＜0.05),见图4、表5。
表3 抑制LINC00355对细胞DU145中miR-494-3p、CCND2表达的影响(，n=9)Tab.3 Effect of inhibiting LINC00355 on expression of miR-494-3p and CCND2 in DU145 cells(，n=9)
表3 抑制LINC00355对细胞DU145中miR-494-3p、CCND2表达的影响(，n=9)Tab.3 Effect of inhibiting LINC00355 on expression of miR-494-3p and CCND2 in DU145 cells(，n=9)
Note:Compared with si-NC group,1)P＜0.001.
Groups miR-494-3p CCND2 mRNA CCND2 protein si-NC 0.98±0.07 1.00±0.05 0.87±0.06 si-LINC00355 1.71±0.091) 0.31±0.031) 0.42±0.041)t 19.208 35.500 18.721 P ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001
图3 P21、E-cadherin、MMP-2蛋白的表达Fig.3 Expression of P21，E-cadherin，MMP-2 protein
2.6 LINC00355靶向miR-494-3p及miR-494-3p靶向CCND2 starBase预测显示LINC00355与miR-494-3p存在结合位点,miR-494-3p与CCND2存在结合位点,见图5A、B。双荧光素酶报告实验结果显示,转染野生型载体WT-LINC00355的细胞实验中,miR-494-3p组荧光素酶活性显著低于miR-NC组(P＜0.05)；转染突变型载体MUT-LINC00355的细胞实验中,miR-494-3p组荧光素酶活性与miR-NC组相比差异无统计学意义(P＞0.05)；转染野生型载体WT-CCND2的细胞实验中,miR-494-3p组荧光素酶活性显著低于miR-NC组(P＜0.05)；转染突变型载体MUT-CCND2的细胞实验中,miR-494-3p组荧光素酶活性与miR-NC组相比差异无统计学意义(P＞0.05),见表6。与pcDNA3.1组相比,pcDNA 3.1-LINC00355组细胞中 miR-494-3p的表达水平显著降低(P＜0.05),见表7。与miR-NC组相比,miR-494-3p组细胞中CCND2 mRNA及蛋白表达水平显著降低(P＜0.05)；与anti-miR-NC组相比,anti-miR-494-3p组细胞中CCND2 mRNA及蛋白表达水平显著升高(P＜0.05),见图5C、表8。
图4 P21、E-cadherin、MMP-2蛋白的表达Fig.4 Expressions of P21，E-cadherin，MMP-2 protein
表4 抑制miR-494-3p能减轻抑制LINC00355对DU145细胞增殖、迁移、侵袭的影响(，n=9)Tab.4 Inhibition of miR-494-3p could reduce inhibitory effect of LINC00355 on proliferation，migration and invasion of DU145 cells(n=9)
表4 抑制miR-494-3p能减轻抑制LINC00355对DU145细胞增殖、迁移、侵袭的影响(，n=9)Tab.4 Inhibition of miR-494-3p could reduce inhibitory effect of LINC00355 on proliferation，migration and invasion of DU145 cells(n=9)
Note:Compared with si-LINC00355+anti-miR-NC group,1)P＜0.001.
Groups miR-494-3p CCND2 Inhibition rate(%)Number of migrating cells Number of invasion cells P21 E-cadherin MMP-2 8±0.04 0.28±0.03 si-LINC00355+anti-miR-494-3p 0.26±0.031)0.78±0.051)18.04±2.011)120±7.881) 71±5.671) 0.25±0.031)0.30±0.031)0.60±0.041)t 37.044 17.493 26.703 17.044 14.492 25.200 28.800 19.200 P＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.si-LINC00355+anti-miR-NC 0.98±0.05 0.44±0.03 52.35±3.42 63±6.21 37±4.17 0.67±0.04 0.7 001 ＜0.001
表5 miR-494-3p能增强抑制LINC00355对细胞DU145增殖、迁移、侵袭的影响(，n=9)Tab.5 miR-494-3p could enhance inhibitory effect of LINC00355 on proliferation，migration and invasion of cell DU145(，n=9)
表5 miR-494-3p能增强抑制LINC00355对细胞DU145增殖、迁移、侵袭的影响(，n=9)Tab.5 miR-494-3p could enhance inhibitory effect of LINC00355 on proliferation，migration and invasion of cell DU145(，n=9)
Note:Compared with si-LINC00355+miR-NCgroup,1)P＜0.001.
Groups miR-494-3p CCND2 Inhibition rate(%)Number of migrating cells Number of invasion cells P21 E-cadherin MMP-2 5 0.30±0.03 si-LINC00355+miR-494-3p 1.68±0.081)0.15±0.021)77.19±4.231) 40±3.581) 24±2.361) 0.92±0.051)1.03±0.061)0.12±0.021)t 20.700 23.297 13.600 11.683 10.434 12.182 9.987 14.977 P＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.si-LINC00355+miR-NC 0.99±0.06 0.43±0.03 51.98±3.61 62±4.37 39±3.61 0.66±0.04 0.77±0.0 001 ＜0.001
图5 LINC00355、miR-494-3p、CCND2之间的靶向关系Fig.5 Targeting relationship between LINC00355，miR-494-3p，CCND2
表6 双荧光素酶报告实验(，n=9)Tab.6 Dual luciferase reporter experiment(，n=9)
表6 双荧光素酶报告实验(，n=9)Tab.6 Dual luciferase reporter experiment(，n=9)
Note:Compared with miR-NC group,1)P＜0.001.
Groups WTLINC00355 MUTLINC00355 WTCCND2 MUTCCND2 miR-NC 0.93±0.06 0.94±0.06 1.01±0.05 0.99±0.06 miR-494-3p 0.35±0.041)0.97±0.06 0.28±0.031)0.97±0.06 t 24.130 1.061 37.558 0.707 P ＜0.001 0.305 ＜0.001 0.489
表7 LINC00355调控miR-494-3p的表达(n=9)Tab.7 LINC00355 regulated expression of miR-494-3p(，n=9)
表7 LINC00355调控miR-494-3p的表达(n=9)Tab.7 LINC00355 regulated expression of miR-494-3p(，n=9)
Note:Compared with pcDNA3.1 group,1)P＜0.001.
Groups miR-494-3p pcDNA3.1 0.96±0.06 pcDNA3.1-LINC00355 0.38±0.041)t 24.130 P ＜0.001
表8 miR-494-3p调控CCND2的表达(，n=9)Tab.8 miR-494-3p regulated expression of CCND2(，n=9)
表8 miR-494-3p调控CCND2的表达(，n=9)Tab.8 miR-494-3p regulated expression of CCND2(，n=9)
Note:Compared with miR-NC group,1)P＜0.001；compared with antimiR-NC group,2)P＜0.001.
Groups CCND2 mRNA CCND2 protein miR-NC 0.98±0.06 0.80±0.04 miR-494-3p 0.27±0.031) 0.33±0.031)anti-miR-NC 0.96±0.06 0.81±0.04 anti-miR-494-3p 1.66±0.082) 1.23±0.062)F 632.221 621.337 P ＜0.001 ＜0.001
3 讨论
前列腺癌细胞增殖及转移能力增强可降低治疗效果及影响患者生活质量,研究表明LncRNA在前列腺癌组织或细胞中表达升高或降低,并可通过影响前列腺癌细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭从而发挥癌基因或抑癌基因的作用[7-9]。但仍有部分LncRNA在前列腺癌发生及发展过程中的调控机制尚未阐明。
LINC00355在膀胱癌、肺腺癌等肿瘤中表达上调,并可促进肿瘤细胞增殖及侵袭,还可作为临床诊断指标[10-12]。与上述研究结果相似,本研究结果显示LINC00355在前列腺癌组织中呈高表达,抑制其表达可明显降低前列腺癌细胞增殖、迁移及侵袭能力。提示LINC00355在前列腺癌发生及发展过程中可能发挥癌基因的作用,抑制LINC00355表达可减弱前列腺癌细胞增殖、迁移及侵袭能力。研究表明P21可负向调控细胞周期,抑制细胞增殖[13]。相关报道指出上皮-间质转化(EMT)与肿瘤细胞转移能力密切相关,其中E-cadherin是EMT上皮表型标志物,其表达量降低可促进EMT的发生进而促进细胞迁移及侵袭。MMP-2属于基质金属蛋白酶类,可通过降解细胞外基质沉积从而促进细胞转移[14]。本研究结果显示抑制LINC00355表达后,前列腺癌细胞中P21、E-cadherin表达量升高,MMP-2表达量降低,提示抑制LINC00355表达可能通过上调P21、E-cadherin表达及下调MMP-2表达从而抑制前列腺癌细胞增殖、迁移及侵袭。
miR-494-3p表达量降低可促进肝细胞癌、口腔鳞状细胞癌发生及发展[15-16]。本研究结果显示miR-494-3p在前列腺癌组织中表达量降低,进一步研究显示抑制miR-494-3p表达可明显促进前列腺癌细胞增殖、迁移及侵袭,说明抑制miR-494-3p表达可减弱抑制LINC00355对DU145细胞增殖、迁移侵袭的影响。同时,miR-494-3p过表达可明显降低前列腺癌细胞增殖、迁移及侵袭能力,说明miR-494-3p过表达可增强抑制LINC00355对DU145细胞增殖、迁移、侵袭的影响。提示LINC00355可能通过下调miR-494-3p表达从而促进前列腺癌发生及发展。研究表明LncRNA H19与CCND2竞争性结合miR-29c-3p从而促进膀胱癌发生及发展[17]。相关报道指出CCND2在宫颈癌中表达量升高,并可促进宫颈癌发生及发展[18]。本研究结果显示CCND2在前列腺癌组织中表达量升高,与上述研究结果相似,提示CCND2在前列腺癌发生过程中可能发挥癌基因作用。本研究结果显示前列腺癌细胞中抑制LINC00355表达后可明显促进miR-494-3p表达、抑制CCND2表达,提示抑制LINC00355表达可能通过调控miR-494-3p/CCND2分子轴从而发挥作用。同时本研究结果证实LINC00355可靶向结合miR-494-3p,miR-494-3p可靶向结合CCND2,LINC00355可负向调控miR-494-3p的表达,miR-494-3p可负向调控CCND2的表达,提示LINC00355可作为竞争性内源RNA而抑制miR-494-3p表达从而间接上调CCND2的表达。
综上所述,LINC00355与CCND2在前列腺癌发生及发展过程中可作为癌基因,二者可竞争性结合miR-494-3p从而促进前列腺癌细胞增殖、迁移及侵袭,LINC00355可能作为前列腺癌靶向治疗的潜在靶点,并为临床前列腺癌的诊断及治疗提供新方向。
